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背景与目的乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤之一,是一种严重威胁女性健康和生命的恶性肿瘤。据国际癌症研究中心统计,全球每年约有46万女性因乳腺癌死亡,约占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7%,占所有女性死亡的1.7%。近年来在我国特别是在一些大城市及沿海经济发展较快的地区,乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。在治疗方面,乳腺癌的5年生存率约为50%-60%。随着人们对乳腺癌认识和研究的不断深入,乳腺癌的治疗也取得了一定的进展,已经从单一的手术治疗发展到多学科的综合治疗。乳腺癌肿瘤标志物的研究有助于对肿瘤高危人群进行筛查和诊断,特别是与纳米制剂、化疗药物等偶联后进行肿瘤的靶向治疗,具有巨大的高效低毒优势。噬菌体展示技术是1985年由美国Missouri大学的G.P.Smith等创立的一项能够特异性筛选多肽或蛋白的技术。该技术将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,与噬菌体的衣壳蛋白融合表达,被展示的多肽或蛋白能够保持相对独立的空间结构和生物活性。目前,噬菌体展示技术已经被广泛应用于肿瘤标志物的筛选、肿瘤药物的靶向运输和多肽药物开发等方面的研究。本文采用噬菌体展示技术,以人乳腺癌MCF-7细胞为靶细胞,对噬菌体随机展示十二肽库进行4轮消减筛选,寻找与乳腺癌细胞MCF-7具有特异性结合力的噬菌体肽序,为进一步研发乳腺癌早期靶向诊断试剂和高效低毒靶向治疗药物奠定基础。方法利用噬菌体展示随机十二肽库,以人乳腺癌MCF-7细胞株为靶细胞,人胚肾HEK293细胞株为非特异性吸附细胞,对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮消减筛选,第四轮不经过扩增,随机挑取60个噬菌体克隆进行扩增、滴定和纯化。利用酶联免疫法(ELISA)初步鉴定阳性噬菌体克隆。选取若干阳性克隆鉴定与乳腺癌细胞的亲和力,并排除假阳性噬菌体克隆,选取已鉴定的阳性噬菌体克隆36个、2个阴性噬菌体克隆和1个无关克隆进行测序,分析其多肽的氨基酸序列组成及基本特征,比较多肽的同源性。最后以细胞免疫荧光法进一步鉴定阳性噬菌体克隆的特异性和敏感性,确定最佳克隆。结果经过四轮全细胞消减筛选后,与人乳腺癌MCF-7细胞结合的噬菌体克隆得到了大幅度富集,从滴定的LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取60个噬菌体克隆,ELISA鉴定其与MCF-7的亲和力,结果显示能与MCF-7结合较好的克隆有36个。测序结果获得7条Consensus序列。以ELISA、细胞免疫荧光法进一步鉴定各Consensus序列的阳性克隆特异亲和力,确定Q35号克隆为最佳阳性克隆。结论本研究利用噬菌体展示技术筛选乳腺癌MCF-7细胞结合的多肽,以ELISA法初步鉴定阳性克隆,选取部分克隆进行了测序,测序结果获得7条Consensus序列。再以ELISA、细胞免疫荧光法进一步鉴定各Consensus序列的阳性克隆特异亲和力,最终确定Q35号克隆为最佳阳性克隆。本研究筛选和初步鉴定获得的乳腺癌靶向多肽克隆具有明显的乳腺癌细胞结合特异性,可以进一步鉴定后用以研发乳腺癌早期靶向诊断试剂、高效低毒靶向治疗药物。