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目的 柯萨奇B组病毒（Coxsackievirus B Group,CVB）为单链RNA病毒，是病毒性心肌炎的主要病原体。病毒的直接溶细胞作用及细胞介导的免疫损伤在病毒性心肌炎发病中起重要作用，而免疫损伤中细胞介导的细胞毒性作用（cell-mediated cytotoxicity,CMC）日益受到重视。CMC在病毒性心肌炎中具有致心肌损伤作用，而病毒性心肌炎的CMC损伤靶细胞主要由穿孔素（PFP）介导。 病毒性心肌炎的发病与细胞因子有密切关系，目前TNF-α是公认的参与心肌损伤的炎性细胞因子，TNF-α与病毒性心肌炎的心肌损害过程及病情程度密切相关，对其检测可作为临床判断病毒性心肌炎患儿病情及预后的指标。 病毒性心肌炎的发病机理至今未明。免疫致病在当前占主导地位，但病毒的直接作用也与病毒性心肌炎密切相关，急性期病毒的复制是心肌病变的重要原因。 近年来，关于新生儿的CVB感染的暴发流行国内外有较多报道，以CVB3，CVB5引起的心肌炎，及并发无菌性脑膜炎最为多见，病死率高，但是目前尚无有效的药物治疗。 本研究为探讨有效的药物治疗及其机制，选取中药黄芪，在实验性小鼠病毒性心肌炎模型上，研究黄芪对柯萨奇B3m病毒感染所致小鼠心肌炎心肌穿孔素mRNA表达和免疫损伤的影响，为黄芪治疗病毒性心肌炎提供理论依据。材料与方法 一、动物模型的制备 24只4一6周龄Ba][b/C小鼠，腹腔接种含2000代ID50的CVB3二病毒液0.2而后，随机分为两组:黄蔑治疗组12只及对照组12只。接种病毒半小时后，黄蔑治疗组每天腹腔注射黄蔑注射液10留kg，对照组每天腹腔注射相同容量的注射用水，连续7天。第8天标本取材:将小鼠眼球后取血约1耐，分离血清，留做肌酸激酶一MB（CK一MB）和肿瘤坏死因子一a（ TNF一a）的含量测定;无菌摘取心脏，一半置4%多聚甲醛固定，留做病理检查，一半置一70℃冷冻，留做逆转录多聚酶链反应（RT一PCR）分析;取左心室心肌薄片用2.5%戊二醛固定，待做电镜检测。 二、主要仪器及试剂 （一）仪器 1.olympus显微镜 2.1200EX透射电镜 3.LKB一V型超薄切片机 4.PCR仪（美国PE一600） 5.Kodak成像分析系统 6.日立7170自动化分析仪 （二）试剂 1.TRIZOL总RNA提取试剂:promega公司;介 kara反转录试剂盒:Takara公司;引物由北京奥科生物技术有限公司合成，以p一肌动蛋白（p-Aetin）为内参照。 2.黄蔑注射液，2扩d，上海福达制药有限公司生产，批号:伪0617。 3.TNF一a放免试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。 三、实验方法 1.心肌组织病理检查 心肌标本经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后，沿左室轴线自心尖部起连续切取两张切片，常规HE染色，光镜下观察心肌病理变化，并计算心肌病变（炎症浸润及坏死）积分，即每张切片取5个高倍视野，计算每个视野中炎症细胞浸润及坏死区域面积占整个视野面积之百分比，无病变计0分，<25%计l分，25%一50%计2分，父%一75%计3分，>75%计4分。 2.心肌组织电镜标本的制备 取左心室心肌组织以2.5%戊二醛固定，1%饿酸后固定，系列乙醇脱水，E一ponslZ树脂包埋，LKB一V型超薄切片机半薄切片，甲苯胺兰染色。光镜下观察定位后，行超薄切片，铅一铀双重染色。在1 ZooEX透射电镜下观察拍照。 3.RT一PCR半定量测定心肌组织PFP、FasL、CVB3。的mRNA表达水平 用TRIZOL总RNA提取试剂提取心肌总RNA，逆转录合成cDNA的第一链，分别扩增PFP、FasL、CvB3。的PCR产物，再经2%琼脂糖凝胶电泳，嗅化乙锭染色后紫外线灯下观察Pr一PCR扩增产物并拍照，以p一Actin（p一肌动蛋白）作为内参照标化待测物质mRNA量，测定PCR产物电泳条带的密度，计算待测物质mRNA的相对量。 4.血清CK一MB含量测定 取血清样本looul，测定CK一MB含量，仪器为日立7170自动分析仪。 5.血清TNF一a含量测定 取血清样本100ul，放免法测定TNF一a含量。 6.统计学分析 数据以均数土标准差表示，用SPSS软件进行t检验，并进行心肌PFPmRNA水平与心肌病变积分、心肌FasL mRNA表达水平的相关性分析，进行心肌PFP mRNA水平与血清CK一MB、TNF一a含量的相关性分析，进行心肌PFP mRNA水平与CvB3.mRNA表达水平的相关性分析。结果 1.心肌细胞组织学改变 两组小鼠心肌均有不同程度病毒性心肌炎的病理改变。表现为灶性或弥漫性以单个核细胞为主的炎性细胞浸润及炎性灶周围心肌细胞的变性坏死。对照组病变较重，小鼠心肌细胞可见大片状弥漫性炎症细胞浸润及心肌细胞坏死;黄蔑治疗组病变较轻，炎症浸润及心肌细胞坏死灶少，且均为·3·小灶性。两组心肌病变积分差异具有非常显著意义（1 .70土0.51与2.98土0 .54，P<0.01）。 2.心肌细胞电镜下超微结构改变 对照组心肌细胞内线粒体肿胀、破裂、空泡样改变，肌纤维断裂、溶解，肌原纤维明暗带模糊;黄蔑治疗组心肌超微结构损伤明显减轻。 3.RT一PCR检测心肌PFP mRNA表达 对照组小鼠心