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研究背景和目的:肺癌,尤其非小细胞肺癌,因早期诊断难,约80%发现时已为晚期,手术难根切,其治疗常以术后化疗为主。但传统化疗,预后差,到了一平台期,已成为治疗“瓶颈”。标准一线治疗,有效率仅15%～36%,生存期8～10个月, 1年生存率30%～40%。要突破这一“瓶颈”,须转变治疗模式。而个性化靶向治疗为这一“瓶颈”的解决提供了有效方案。近年来,现代分子生物学技术的迅猛发展给恶性瘤的治疗带来了新希望。分子靶向治疗的介入,使肿瘤个体化治疗跨上了新的台阶。大量临床研究充分证实了肿瘤分子靶向治疗理论的正确与可行。靶向治疗的范围涵盖一线治疗、维持治疗及二线治疗。但随之而来的问题是如何克服继发性耐药,如何恰当筛选受益人群,尤其如何寻找新的治疗靶点更引起人们的重视。肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor,TNF）相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand, Trail）基因,存在于胎盘、肺、肾、脾及外周淋巴等组织的细胞中,具有重要诱导肿瘤细胞凋亡之作用。Trail的胞外区（114～281氨基酸残基）能形成可溶性Trail分子（sTrail）,在体外它能广泛引起多种肿瘤细胞凋亡,对正常细胞却无毒副作用,其诱导肿瘤细胞的凋亡不依赖p53分子是否突变。因此,sTrail在肿瘤治疗中具广泛应用前景。尿激酶型纤溶酶型激活剂（urokinase plasminogen activator,uPA）是一含411个氨基酸,分子质量50～60 kD的糖蛋白。正常组织细胞中,uPA及其uPAR的表达极低,但几乎所有肿瘤,两者明显高表达。uPA与肿瘤的生长、浸润与转移等均密切相关,因此,其被视为重要的肿瘤标志物和极具魅力的肿瘤治疗靶标。因此,本研究旨在探讨含uPA裂解位点的人TNF可溶性相关凋亡诱导配体（TNF- sTRAIL）基因重组目的蛋白的体外抗非小细胞肺癌活性,为进一步研究其体内肺癌的靶向治疗奠定基础。方法:本实验采用基因工程技术将多串联His肽序列与uPA的裂解位点（SGRSA）序列引入人sTrail的C端,使其蛋白分子构象发生改变,使之成为受His肽与uPA裂解位点封闭的暂无活性（或低活性）的融合分子,其具体组成顺序,从N端到C端依次为:成熟的sTrail→uPA的裂解位点序列→多串联His肽。我们克隆到sTrail-uPA-his的融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a,诱导其表达含载体标签（Trx）的融合蛋白,EK酶切去其标签蛋白,获目的蛋白sTrail-uPA。纯化该目的蛋白后行免疫原性鉴定。体外实验证实uPA酶可裂解sTrail-uPA释放具杀瘤活性的sTrail,具体如下。一、含uPA裂解位点的人sTrail基因原核蛋白表达与纯化研究1.人sTrail基因的克隆及其原核质粒pMDl8-T/sTrail的构建设计扩增sTrail基因引物,以人胎盘组织总RNA为模板,RT-PCR法扩增sTrail基因的全长cDNA序列,构建其原核质粒pMDl8-T/sTrail,测序证实是否克隆到sTrail基因全长编码序列。2.含uPA裂解位点的人sTrail基因原核表达质粒pET-32a/sTrail-uPA-his的构建设计PCR法构建sTrail-uPA-his融合基因引物,以pMD18-T/sTrail为模板,采用引物延伸法,进一步构建含uPA裂解位点（SGRSA）的sTrail基因的重组原核表达质粒。测序证实是否成功构建携带sTrail基因的pET-32a/sTrail-uPA-his重组原核表达载体。3.融合蛋白sTrail-uPA-his的诱导表达与纯化测序正确的重组质粒pET-32a/sTrail-uPA-his转化表达菌BL21（DE3）。挑阳性克隆培养,28℃,IPTG过夜诱导。SDS-PAGE检测表达产物是否正确,检测其表达量。收取诱导细菌,重悬菌体,超声破碎,镜检破菌效果。留取破菌上清及沉淀,过滤上清。金属螯合Ni2+柱中装入填料。上清上样,收集穿透液,复平衡,分别用5%、10%和100% Elution Buffer洗脱,100%组分透析于Tris缓冲液。SDS-PAGE电泳检测是否纯化到融合蛋白。4.sTrail-uPA-his融合蛋白的酶切、纯度检测与免疫学鉴定向融合蛋白溶液中加入EK酶,过夜酶切,留取未切样品作对照,SDS-PAGE电泳检测是否切下目的蛋白与标签蛋白。酶切后的目的蛋白行高效液相色谱（high performance liquid chromatogram,HPLC）分析,归一法计算知其纯度。电泳后的目的蛋白转移至硝酸纤维膜,浸泡于含人Trail羊多抗封闭液,过夜孵育,加辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗,室温孵育与化学发光底物结合,拍照并存图。以此鉴定目的蛋白是否具人Trail抗原性。二、含uPA裂解位点的人sTrail基因原核蛋白抗非小细胞肺癌的活性研究1. sTrail-uPA重组蛋白经uPA体外裂解的杀瘤IC50计算将人非小细胞肺癌NCI-H460细胞接种于96孔板（3000个细胞/150μl/孔）,37℃、5%CO2环境培养24 h,加入不同浓度纯化的sTrail-uPA重组蛋白与uPA酶,分别以仅加sTrail-uPA重组蛋白、uPA酶及不处理的细胞做对照,作用24 h,加入CCK-8（cell counting kit-8）试剂相同条件下继续培养4 h,紫外高效分析仪测定450 nm波长处光密度值,计算知其IC50。2. sTrail-uPA重组蛋白体外对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响以1×106/ml接种对数生长期NCI-H460细胞,培养24 h,分别加入不同终浓度的重组蛋白sTrail-uPA与uPA酶,相同条件下分别培养24 h和48 h,单纯NCI-H460细胞作对照。收集细胞,用Annexin V-PI双染法处理,流式细胞仪检测瘤细胞凋亡情况。以此检测目的蛋白sTrail-uPA经uPA酶体外裂解能否释放具杀伤活性的sTrail诱导非小细胞肺癌细胞NCI-H460的凋亡,且该凋亡诱导是否具“剂量-依赖”与“时间-依赖”特性。3. sTrail-uPA重组蛋白对非小细胞肺癌细胞生长的影响-增殖曲线绘制将H460细胞接种至4个96孔板（3000个细胞/150μl/孔）,培养24 h后加入sTrail-uPA蛋白与uPA酶,分别以单纯sTrail-uPA蛋白、单纯uPA酶作用于H460细胞及单纯H460细胞做对照,单纯培养液为空白对照,分别于24 h、48 h、72 h、96 h取出一96孔板,每孔加换新培养基与CCK-8,相同条件下继续培养4 h,振荡30秒混匀,紫外高效分析仪测定450 nm波长处光密度值,以光密度值为Y轴,时间为X轴绘制增值曲线。以此检测经uPA酶体外裂解的sTrail-uPA目的蛋白抑制瘤细胞生长的活性。结果:一、含uPA裂解位点的人sTrail基因原核蛋白表达与纯化研究1.测序证实,克隆到sTrail基因全长编码序列,并成功构建其原核质粒pMDl8-T/sTrail。2.测序证实,携带含uPA裂解位点（SGRSA）的sTrail基因的pET-32a/sTrail-uPA-his重组原核表达载体得以成功构建。3.重组质粒pET-32a/sTrail-uPA-his经诱导可表达一融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的55%。该融合蛋白经金属螯合Ni2+柱纯化后,SDS-PAGE电泳检测其分子质量约38 kD。4.纯化后的融合蛋白经EK酶切,可分别切下约19.5kD的目的蛋白sTrail-uPA与18.5kD的Trx-His标签蛋白。5.酶切后的目的蛋白行HPLC分析,归一法计算知其纯度达98.6%。6.目的蛋白行Western blot免疫学鉴定结果显示,在约19.5kD处出现相应的染色带,可见目的蛋白具人Trail抗原性。二、含uPA裂解位点的人sTrail基因原核蛋白抗非小细胞肺癌的活性研究1. sTrail-uPA重组蛋白经uPA酶体外裂解可释放对人肺癌NCI-H460细胞具杀伤活性的sTrail,该杀伤活性呈明显剂量-效应关系,其IC50为20 ng/ml。2.流式细胞仪检测显示,25 ng/ml重组蛋白sTrail-uPA与uPA酶作用NCI-H460细胞24 h和48 h的细胞凋亡率分别为（8.85±1.36） %与（22.74±3.18） %,两者相比,差异具统计学意义（P <0.05）;100 ng/ml重组蛋白sTrail-uPA与uPA酶作用NCI-H460细胞48 h的细胞凋亡率为（ 34.95±3.09）%,与相同作用时间的25 ng/ml重组蛋白sTrail-uPA与uPA酶作用NCI-H460细胞比较,差异也具统计学意义（P<0.01）。提示重组目的蛋白sTrail-uPA经uPA酶体外裂解能释放具杀伤活性的sTrail诱导非小细胞肺癌细胞NCI-H460的凋亡,且该凋亡诱导具“时间-依赖”与“剂量-依赖”特性。3.从sTrail-uPA重组目的蛋白对非小细胞肺癌细胞生长曲线的影响知,sTrail-uPA重组蛋白经uPA酶体外裂解释放具杀伤活性的sTrail对人肺癌NCI-H460细胞生长具显著杀伤作用（与对照细胞和uPA酶处理的细胞比较,P<0.01;在处理后培养2-4天,与sTrail-uPA蛋白单独处理的细胞比较,P<0.05）。结论:1.克隆到含uPA裂解位点的融合基因sTrail-uPA,并成功构建其原核表达载体pET- 32a/sTrail-uPA-his.2.酶切、纯化载体pET-32a/sTrail-uPA-his经诱导所表达的融合蛋白sTrail-uPA -his后,得纯度达98.6%,分子量为约19.5 kD的目的蛋白sTrail-uPA。3.目的蛋白sTrail-uPA经uPA酶体外裂解可释放对瘤细胞具杀伤活性的sTrail,其IC50为20 ng/ml。该杀伤活性的sTrail可明显抑制人肺癌NCI-H460细胞生长,显著诱导该瘤细胞的凋亡。