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细菌是存在于自然环境中的一个重要生物类群，参与自然环境碳、氮和硫等元素的循环，另外，细菌在人类的健康与疾病、工业微生物发酵及农业生物病虫害防治等领域也占有重要地位。一套有效的遗传操作系统是研究细菌生理功能、致病机理及构建基因工程菌株的先决条件。迄今为止，仅有有限的实验室培养菌株实现了遗传转化，仍有部分种属的细菌未能实现遗传转化，而已实现遗传转化的细菌种属中也有部分菌株不能进行转化。顽固细菌遗传操作困难主要有细胞壁结构复杂、含有内生性质粒和限制修饰系统降解外源DNA三方面的原因。本论文以四株含有多套限制修饰系统的顽固细菌--鸟苷工业生产菌Bacillus amyloliquefaciens TA208、条件致病菌Bacillus cereusATCC10987、亚硝酸盐氧化细菌Nitrobacterhamburgensis X14及氨氧化细菌NitrosococcusoceaniATCC19707为研究对象，通过联合细胞壁弱化和细胞膜扰动、解析DNA甲基转移酶操控下的DNA甲基化模式，及DNA甲基化模式在大肠杆菌中的模拟实现顽固细菌的遗传操作。
首先，优化了感受态细胞制备培养基、细胞壁弱化和细胞膜扰动试剂的浓度和它们的配比，以及电转缓冲液配方，得到了一种高效的电转化方法。在B.amyloliquefaciensTA208中利用内源性的pUB110质粒获得了1.13±0.34×107cfu/μg DNA的转化率；对于大肠杆菌来源的质粒，结合M.BamHI甲基转移酶体外甲基化和热失活宿主限制修饰系统的方法使穿梭质粒pHCMC02的转化率提高至了8.94±0.77×105cfu/μg DNA。
为了解析限制修饰系统操控下的DNA甲基化模式，通过高通量测序的方法获得了菌株TA208的全基因组序列。利用一系列的生物信息学方法对菌株TA208和参照菌株进行了比较基因组学分析。菌株TA208中接近全基因组序列1/3的一个大片段发生了倒位，在菌株TA208中发现了解淀粉芽胞杆菌的一个新的原噬菌体位点Prophage2。对嘌呤合成和代谢途径编码基因的序列分析表明腺苷琥珀酰合成酶活性缺失、嘌呤透性酶缺失可能是菌株TA208鸟苷高产的原因。另外，嘌呤合成途径中多个酶所发生的点突变也是潜在的高产原因，突变可能提高了关键分支酶的活性，或解除了产物反馈抑制。comS基因功能丧失导致的自然感受态能力缺失、限制修饰系统的复杂性是菌株TA208遗传操作困难的主要原因。
为了在大肠杆菌中模拟四株顽固细菌的DNA甲基化模式，以Escherichia coliTOP10为出发菌株，敲除dcm基因，将recA1基因回复突变为野生型，并敲除dam基因构建了一株内源性限制修饰系统全部缺失的菌株E.coil EC135。通过甲基化敏感性限制酶切、测序峰图比对发现敲除dcm基因使菌株丧失了修饰CCWGG序列的能力；recA定点回复突变使菌株提高了对萘啶酮酸的抗性；通过甲基化敏感性限制酶切、测序峰图比对和2-氨基嘌呤敏感性实验发现敲除dam基因使菌株丧失了对GATC序列修饰的能力。
在E.coil EC135中克隆表达了来自四株顽固细菌的44套DNA甲基转移酶，免疫杂交实验表明22套具有DNA修饰活性，其中BCE_0392、Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803、Nham_3225、Noc_0344、Noc_0419和Noc_A0028具有N6mA的修饰活性，BAMTA208_06525、BAMTA208_16660、BCE_5606、BCE_5607、Noc_0059、Noc_0655、Noc_1158-Noc_1159-Noc_1160、Noc_1367和Noc_2196具有N4mC的修饰活性，BAMTA208_6715、BAMTA208_19835、BCE_0365、BCE_0393和BCE_4605具有5mC的修饰活性。然后分别为四株顽固细菌构建了甲基转移酶共表达宿主E.coil EC135/pM.Bam、EC135/pM.Bce、EC135/pM.Nham和EC135/pM.Noc，对有活性的DNA甲基转移酶进行了共表达。免疫杂交结果表明大肠杆菌的DNA甲基化模式已经成功更改，与顽固细菌的模式相似，实现了甲基化模式的模拟(mimicking ofDNA methylation patterns，MoDMP)。
最后，验证了甲基化模式模拟的方法在顽固细菌遗传操作中的有效性。经过甲基化模式模拟的不同穿梭质粒对B.amyloliquefaciens TA208的转化率提高了102～105倍，其中转化率最高的质粒为pMK4，为3.0×106cfu/μg DNA。另外，还利用一个整合质粒在B.amyloliquefaciens TA208中实现了upp(uracil phosphoribosyltransferase)基因的敲除，完成了顽固细菌B.amyloliquefaciens TA208遗传操作系统的构建。MoDMP能够使穿梭质粒对B.cereusATCC10987的转化率提高10～103倍，其中pMK4质粒的转化率最高，从EC135/pM.Bce中制备的质粒转化率达到2.3×107 cfu/μg DNA。另外，利用MoDMP模拟系统首次实现了对N.hamburgensis×14的遗传转化和GFP的表达。
本研究的结果为顽固细菌的遗传操作提供了一种有效的方法，MoDMP系统可应用于革兰氏阳性与革兰氏阴性、化能自养与异养的细菌，在不同种属细菌中的适用性表明MoDMP系统可被应用于多株已知全基因组序列的、尚不能进行遗传转化的细菌的遗传操作。