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随着工业科技的快速发展,现代科学在改善人类生活水平的同时,也大大增加了人们与亲肝毒物的接触几率,肝损伤发病率逐年增加,严重威胁了人们的身体健康和生活质量。肝脏组织作为人体内最大的消化和代谢器官,其主要功能为解毒作用,因而肝脏极易受到各类有毒物质的侵袭而受到损伤。空气质量下降、环境污染严重、过量饮酒和滥用药物等多种因素均会引发化学性肝损伤。长期持续或短期剧烈的肝损伤可进一步发展为脂肪肝、肝炎、肝硬化,甚至是肝癌。目前,现存的防治肝脏疾病的药物普遍存在疗效差且毒副作用大等缺点;因此,研发低毒副作用且防治效果好的保肝药物是防护化学性肝损伤及降低肝脏疾病发病率的重要措施之一。本研究以东北地区特有的红松(Pinus koraiensis)松仁为研究对象,采用水提醇沉法从红松松仁中提取天然多糖,利用响应面设计法优化松仁多糖的提取工艺参数;通过体外活性跟踪,筛选出松仁多糖中具有最强保肝活性的组分PNP40c-1,并对其分子结构进行表征。此外,本论文系统地研究了松仁多糖PNP40c-1体外消化产物对四氯化碳(CCl4)性肝损伤、酒精性肝损伤和药物性肝损伤的体外防护作用,通过比较筛选确定其对CCl4诱导的肝损伤具有最强保护作用,并结合动物实验揭示PNP40c-1保肝作用分子机制。采用Box-Behnken响应面优化法确定松仁多糖的最佳提取参数条件为:料液比1:40(g/m L),提取温度95℃,单次提取时间1.5 h,提取次数3次,多糖得率为9.26±0.10%。对所提取的松仁粗多糖依次采用DEAE-52和Sephacryl S400分离纯化,利用L-02细胞建立体外化学性肝损伤模型筛选出松仁多糖中具有保肝作用的主要活性成分为PNP40c-1。通过HPGPC、GC-MS、FT-IR、1D-NMR和2D-NMR等多种方法对PNP40c-1进行结构表征,确定PNP40c-1是平均分子量为2.06×105?Da的均一多糖组分,其主要由阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖组成,摩尔比为2.98:1.00:0.52。PNP40c-1的主链结构由→3,4)-α-L-Arap(1→,→4)-α-L-Arap3Me(1→,→3)-α-L-Rhap(1→和→6)-β-D-Glcp(1→所组成,支链结构为β-D-Glcp-(1→,连接于→4)-α-L-Arap3Me(1→的C4位置。在体外模拟消化中,PNP40c-1在模拟唾液消化后,平均分子量并未发生明显变化;在模拟胃液和小肠液消化后,多糖平均分子量有所下降,还原末端含量显著增加,而体外消化过程中并未检测到游离单糖的释放,表明PNP40c-1在唾液-胃液-肠液三步连续体外消化中发生糖苷键断裂,导致多糖平均分子量下降。基于L-02细胞实验比较PNP40c-1体外消化产物对CCl4、乙醇和对乙酰氨基酚(APAP)诱导肝损伤的防护作用,确定其对CCl4诱导的化学性肝细胞损伤具有最强的保护作用;并对其抗CCl4诱导肝损伤的体外防护作用进行深入研究,发现PNP40c-1体外消化产物不仅可以通过激活KEAP1/NRF2/ARE途径,显著促进靶向基因HO-1、GCLC和NQO1等表达,提高肝细胞抗氧化酶活力和抗氧化物质含量,降低脂质过氧化水平,减少细胞内ROS的产生,防护CCl4诱导的肝细胞氧化损伤;也可以通过降低细胞色素P450的表达,减少CCl4在肝细胞内的氧化分解反应,降低氧化损伤;同时抑制肝细胞中凋亡蛋白Caspase-3激活,阻碍细胞凋亡途径。此外,PNP40c-1体外消化产物也具有抗炎作用,能够有效抑制脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞中炎性因子的表达和分泌,缓解炎症反应。建立CCl4诱导小鼠肝损伤模型,探究PNP40c-1对体内CCl4诱导肝损伤的防护作用机制,结果表明PNP40c-1对CCl4引起的小鼠肝损伤具有显著的防护作用,既可通过NRF2/ARE信号通路调节细胞内氧化还原状态,促进抗氧化基因表达,提高肝细胞抗氧化应激能力,防护CCl4所引起的肝细胞氧化损伤;也能够通过NRF2/ARE/MKP1/JNK途径促进MKP1蛋白表达,有效抑制过量自由基激活JNK途径,阻碍细胞凋亡,降低肝细胞内促凋亡蛋白Bax和cleaved-Caspase-3的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl2水平,减少CCl4所引起肝细胞凋亡,起到保肝作用。此外,PNP40c-1还可以通过抑制IKKβ和IκBα的磷酸化水平,减少NF-κB核转移,阻碍NF-κB与细胞核中靶向基因结合,降低炎性介质过度分泌,缓解CCl4引起的肝脏局部炎症反应,共同起到防护CCl4诱导肝损伤和保护小鼠肝脏组织的作用。本论文从红松松仁中分离纯化出具有保肝活性的多糖组分PNP40c-1,并对其分子结构进行表征分析;同时也证明了其对CCl4诱导的化学性肝损伤具有体内外防护作用,并揭示了保肝作用的分子机制,以期为开发和综合利用红松资源提供理论依据,同时也为进一步研发天然高效、低毒副作用的保肝药物和功能食品拓展新思路。