G蛋白信号转导调节子5参与实验性脉络膜新生血管及其可能的机制

• 作 者: 叶子
• 机 构: 第四军医大学
• 出 处: 第四军医大学
• 发表日期: 2010年期
• 关键词: 脉络膜新生血管 G蛋白信号转导调节子5 血管内皮生长因子 视网膜色素上皮

研究背景脉络膜新生血管（CNV）是眼内新生血管的重要表现形式之一,常导致严重的视力丧失,其生成是一个十分复杂的过程,受多种因素或因子精细而敏感的调控。Bruch膜损伤和缺氧是CNV形成的重要机制,前者可降低营养物质运输能力和增加脂质沉积,导致Bruch膜发生断裂,新生血管通过断裂的Bruch膜长入视网膜下间隙;后者可诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞数量和功能改变,释放多种细胞因子,导致RPE-Bruch膜-脉络膜毛细血管复合体完整性破坏,促进内皮细胞增生和移行,最终形成新生血管。G蛋白信号转导调节子5（RGS5）属于RGS蛋白超家族中的R4/B亚科,不仅负向调控G蛋白偶联受体相结合的信号转导,还能抑制该通路下游的酪氨酸激酶激活小G蛋白/丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活,与缺氧及病理性新生血管形成密切相关,且这一作用可能与血管内皮生长因子（VEGF）有关。VEGF是RPE细胞分泌的因子之一,在CNV的发生中起着重要的作用。贝伐单抗（Avastin）作为抗VEGF重组单克隆抗体,能阻断VEGF-A所有亚型与内皮细胞表面受体的结合,通过抑制VEGF活性,达到有效阻碍CNV形成的目的。目的探讨RGS5参与体内实验性CNV生成及在体外缺氧环境下RPE细胞中表达的可能机制。方法（1）532nm激光诱导88只（176眼）雄性棕色挪威（BN）大鼠实验性CNV。首先按时间分为光凝后1d（n=6）、3d（n=6）、7d（n=7）和14d（n=21）四组,观察RGS5及VEGF的表达;选取光凝7d（n=12）和14d（n=36）作观察点,按处理因素分为生理盐水组及Avastin注射组,观察通过特异性抑制VEGF表达对RGS5表达产生的影响;（2）在正常培养的人RPE细胞培养基中加入终浓度为200μM的CoCl2建立细胞化学缺氧模型。按缺氧时间分为0、1、3、6、12和24h六组,观察RGS5和VEGF表达的变化;另选取12h和24h作观察点,按处理因素分为缺氧对照组和Avastin处理组,Avastin包括25μg/ml、100μg/ml和250μg/ml三种浓度,观察抑制VEGF表达后RGS5表达的变化。采用组织病理学切片和脉络膜铺片分别观察CNV厚度和面积;免疫荧光染色法、Western blot和RT-PCR分别检测RGS5和VEGF蛋白与mRNA的表达。采用Student’s t-检验进行统计学分析。结果（1）光凝后1d、3d、7d和14d,RGS5蛋白及mRNA相对表达量均于1d(t_1d=3.451,P < 0.05;t_1d=3.646,P < 0.05)和3d(t_3d=3.085,P < 0.05;t_3d=3.888,P < 0.05)下降,7d开始上升,14d(t_14d=2.079,P < 0.05;t_14d=2.194,P > 0.05)达到高峰;VEGF蛋白及mRNA相对表达量均于7d(t_7d=7.959,P < 0.01;t_7d=7.959,P < 0.01)达到高峰,14d有所下降,但仍高于正常水平。RGS5表达高峰晚于VEGF出现;玻璃体腔注射Avastin后,CNV生成的厚度和面积均减小（t=2.616,P < 0.05;t=15.179,P = 0.000）,光凝后7d VEGF蛋白和mRNA的表达及光凝后14d RGS5蛋白和mRNA的表达均下调;（2）在上述结果基础上,选择RPE细胞进行体外实验得到,正常条件下RGS5主要表达于人RPE细胞胞浆中,与VEGF存在共表达区域。随着缺氧时间的延长,RPE细胞中RGS5蛋白及mRNA表达逐渐上调,24h时表达达高峰(0.932±0.104,t₂₄=3.106,P=0.011;0.742±0.083,t₂₄=2.852,P=0.017);VEGF蛋白及mRNA表达12h达到高峰(1.022±0.141,t₁₂=4.144,P=0.002;0.491±0.063,t₁₂=5.707,P=0.000),24h有所下降,但仍高于未缺氧的RPE细胞(0.942±0.125,t₂₄=3.306,P=0.008;0.425±0.080,t₂₄=3.239,P=0.011)。浓度为100μg/ml和250μg/ml的Avastin有效抑制VEGF蛋白(t₁₀₀=2.794,P=0.019;t₂₅₀=3.396,P=0.007)和mRNA(t₁₀₀=2.823,P=0.018;t₂₅₀=9.584,P=0.000)表达后,RGS5蛋白(t₁₀₀=2.953, P=0.014;t₂₅₀=2.913, P=0.015)和mRNA(t₁₀₀=3.009, P=0.013;t₂₅₀=4.243, P=0.002)表达受到抑制。结论RGS5与VEGF表达和CNV生成相关,且两者表达有时相关系;通过抑制VEGF表达有效抑制CNV过程中,RGS5表达下调。在此基础上体外实验结果提示,正常条件下RGS5表达于RPE细胞胞浆中,与VEGF存在共表达区域;RGS5和VEGF的表达具有时相关系,通过抑制VEGF,RGS5表达随之降低。综上提示RGS5可能位于VEGF信号通路下游,参与了VEGF相关的CNV生成机制,且与CNV发生相关的RGS5表达可能部分是RPE细胞源性的。