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稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是水稻生产上最具破坏性的病原菌之一,它引起的稻瘟病严重威胁着全球水稻的生产安全。目前,抗病品种和化学药剂是控制该病最经济有效的措施,但是,由于该病原菌易变,新的致病和抗药性群体的产生容易导致选育的抗病品种和药剂失去利用价值。因此,稻瘟病的防治始终是水稻生产上的一个重要难题,而对该病原菌的生长发育及致病分子调控机制的研究是控制该病害的重要前提。而且,近年来水稻和稻瘟病菌全基因组测序工作的完成使两者组成了具有理论研究价值的植物-病原菌互作模式系统。本文系统地研究了稻瘟病菌菌株98-06基因组水平的变异特点、其与水稻互作的转录模式和非保守基因组区域的基因功能，并在此基础上筛选出133个候选无毒基因,同时鉴定了3个稻瘟病菌效应分子,研究结果有助于理解稻瘟病菌的进化机制,对无毒效应分子的挖掘有参考价值。研究结果如下:稻瘟病菌菌株98-06的全基因组序列分析。选取了一个在田间表现高毒力并推测含有12个已知无毒基因的稻瘟病菌株98-06进行全基因组测序,并与已公布的菌株70-15、P131、Y34进行比较分析。利用全基因组鸟枪法(WGS)建Paired-End片段库进行Illumina高通量测序后得到了98-06的原始序列,总覆盖率达到135倍,远高于其它已测序菌株,从而获得拼接质量较高的基因组序列。将98-06与参考实验室菌株70-15进行比较发现,有1.5 Mb菌株特有序列和249个菌株特异基因,这些序列和基因分散位于整个基因组中,并且倾向于分布在染色体的两端,提示这些基因在菌株的基因组进化过程中可能具有重要的作用。同时,对98-06基因组序列进行了基因预测、基因家族分析、重复序列和转座子分析。进一步对目前报道的15个稻瘟病菌效应分子进行生物信息学分析,发现长度小于200 aa和半胱氨酸含量较高外泌蛋白可作为候选的效应分子,根据这个标准从98-06基因组的1,732个外泌蛋白中筛选得到645个候选效应分子。98-06菌株和水稻互作转录组分析。在对98-06菌株进行全基因组序列分析的基础上,我们利用高通量的RNA测序技术对菌株98-06与水稻亲和互作的不同阶段(包括菌丝阶段、孢子阶段、侵染8小时、24小时、48小时和72小时)进行了转录组分析。RNA测序产生的大量reads分别与稻瘟菌、水稻的基因组序列进行比对,共获得11,078个稻瘟菌和26,452个水稻的基因转录数据。在转录数据的基因表达结果中,筛选出样品间差异表达的基因。通过对已报道的63个致病相关基因和10个效应分子进行基因表达模式分析,发现了关键的致病相关基因和效应分子相关的转录模式,致病相关转录模式表现为侵染8小时至24小时下调表达,而24小时至72小时又呈上调表达趋势;效应分子相关的转录模式表现为菌丝和孢子阶段表达量很低,而在侵染阶段高量上调表达。这一结果提示,这两种转录模式可用来预测新的致病相关基因和效应分子。差异表达基因以及水稻中SA、JA、ET信号通路的分析都表明,在稻瘟菌-水稻互作过程中大量的基因受到调控上升表达,两者之间存在激烈的"战争"。进一步根据已克隆的Avr-Pik/km/kp和Avr-Pizt转录特征从预测的645个候选效应分子中筛选出具有相似转录模式的133个候选的无毒效应分子,对其中的15个98-06菌株特有的编码外泌蛋白的基因采取CAST分析预测到6个新的效应分子。三个候选效应分子和两个98-06特有基因功能分析。前面对稻瘟病菌98-06基因组和互作转录组进行了分析,本部分进一步对候选的效应分子及菌株特异基因进行功能研究。候选效应因子PEX6和PEX9是98-06菌株特有基因,PEX12预测含有核定位信号,PEX17和PEX18是98-06菌株特有基因、SMART预测有功能域的两个非编码外泌蛋白基因。3个候选效应分子均在侵染阶段显著上调表达,PEX17、PEX18在不同时期的转录水平变化不大。对5个基因在42个菌株中进行PCR扩增,结果显示它们具有有/无的多态性。将这5个98-06菌株特异基因进行基因敲除的功能研究表明,有的菌株特异基因参与了稻瘟病菌的生长、产孢或致病过程。对候选效应分子进行GFP荧光定位观察,Pex6、Pex9、Pex12聚集在稻瘟菌特异的外泌结构——BIC(biotrophic interfacial complex)中。Pex6、Pex9、Pex12在烟草中表达能够抑制BAX引起的坏死,且Pex12定位在烟草的细胞核中。进一步将PEX6、PEX9、PEX12在自身启动子驱动下导入Guy11中,在含有单抗病基因的水稻品种上进行致病性测验,排除了它们是无毒基因Avr-Pikh、Avr-Piz5、Avr-Pish、Avr-Pi1、Avr-Pi7、Avr-Pi20和Avr-Pita2的可能性。试验中发现PEX12作为效应分子导入Guy11菌株中表达后,使Guy11在含单抗病基因Pib水稻品种K14上,由抗病变成感病,在分别含单抗病基因Pi11、Pi12的水稻品种K30、K23上由中等抗病转变为高度感病。推测Pex12可能具有抑制ETI(Effectors Triggered Immunity)并促进病斑扩展的重要作用。Pex12效应分子能够抑制水稻中ETI在稻瘟病菌效应分子的研究中尚属首例。Pib、Pi12、Pi11抗病品种在田间的抗谱窄,而对PEX12的多态性分析显示,Pex12效应分子在田间广泛存在,因此推测Pex12可能是导致这3个抗病品种"失效"的原因。将来对Pex12抑制ETI的分子机制的解释将有助于稻瘟病菌和水稻的互作致病机制,Pex12可望为新型抗稻瘟病药剂提供靶标。此外,我们还对稻瘟病菌的转录因子MYB1进行了深入的功能研究,有助于我们更好的了解丝状真菌中MYB类转录因子所起的作用。综上所述,本研究系统深入地对稻瘟病菌田间菌株98-06的全基因组和互作转录组分析,发现98-06与参考菌株70-15的全基因组序列相比具有1.55 Mb的菌株特有序列,这些序列倾向于分布在靠近染色体两端,可能与基因组进化以及菌株对环境的适应性相关。在此基础上,对菌株不同阶段的转录分析发现了关键的致病相关转录模式,并根据已鉴定的效应分子转录模式筛选出候选的效应分子,对菌株特异效应分子Pex6、Pex9、Pex12进行了功能分析,发现Pex12对水稻中的ETI具有显著的抑制作用。上述研究结果对阐明稻瘟病菌菌株的进化及解释致病分子机制具有参考价值。