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药效物质是中药发挥疗效的物质基础，是中药品质的物质内涵。菘蓝Isatisindigotica Fort，根入药，习称板蓝根，为清热解毒类的代表中药。以落叶松脂素为代表的木脂素类成分是板蓝根发挥抗病毒活性的重要物质基础，然而其在板蓝根中的含量极低（约68μg/g）。植物次生代谢工程为提高菘蓝中落叶松脂素含量、提升药材的品质提供了可行之路。然而，目前调控菘蓝落叶松脂素生物合成的关键靶点尚不清楚，制约了应用代谢工程策略实现菘蓝品质提升的研究与实践。 本论文在前期完成菘蓝的转录组测序的基础上，应用系统生物学方法挖掘参与落叶松脂素生物合成的关键调控因子（包括转录因子和合成途径基因）并进行功能研究，进一步阐释板蓝根中木脂素类成分生物合成的调控机制，为获得落叶松脂素高积累的优质菘蓝品系提供代谢工程新策略。主要研究内容如下: 菘蓝WRKY转录因子家族基因的发现与功能评价:四倍体菘蓝是乔传卓教授等历经数十年多倍体育种获得的菘蓝优良品系，与原二倍体亲本相比，四倍体菘蓝的根、叶增产显著，且表现出稳定的高水平抗病毒活性。然而，导致两种倍性菘蓝品质差异的分子机制尚不清楚。课题组前期利用拟南芥基因芯片对两种倍性菘蓝的基因表达进行比较研究，发现四倍体菘蓝中某些WRKY转录因子家族基因的表达水平显著高于二倍体亲本，并构成了差异基因最重要的组成部分。据此，推测四倍体菘蓝的高品质很可能与这些WRKY基因的高表达密切相关。然而，由于缺乏菘蓝WRKY转录因子家族基因（liWRKYs）的信息，差异liWRKYs仍不明确。本论文对菘蓝WRKY转录因子家族基因（IiWRKYs）进行了系统的研究，明确了两种倍性菘蓝的差异IiWRKYs，阐释了差异IiWRKYs表达水平与菘蓝品质形成的相互关系，并对参与菘蓝抗病毒活性成分落叶松脂素生物合成的关键IiWRKY进行了筛选。具体研究结果如下: 1.通过菘蓝转录组数据的注释，共获得了64个IiWRKYs(IiWRKY1-64)，按照WRKY结构域的数量及锌指结构特征，将IiWRKYs分为3大类(Ⅰ-Ⅲ)，进化树分析发现IiWRKYs符合植物中WRKY转录因子从Ⅰ经Ⅱ到Ⅲ的进化规律; 2.按照比较基因组学的研究思路，将IiWRKYs与拟南芥WRKY转录因子家族基因(AtWRKYs)进行比对，并结合前期拟南芥基因芯片筛选获得的两种倍性菘蓝的差异WRKY探针的信息，通过实时定量PCR验证，明确了 liWRKY33、liWRKY34、liWRKY48、IiWRKY49和IiWRKY50为两种倍性菘蓝的差异基因; 3.以拟南芥数据库信息(http://string-db.org/)为模型，构建liWRKYs的关联性网络，发现差异基因Ii WRKY33、IiWRKY34、liWRKY48、liWRKY49和liWRKY50位于植物抗逆和信号转导调控网络的核心位置，有效诠释了与WRKY相关的调控四倍体菘蓝高品质形成的遗传基础:正是这些参与植物抗逆、信号转导的IiWRKYs的高表达使四倍体菘蓝具有更好的抗逆能力，表现出更好的生长性状（根、叶增产、高含量的植保素木脂素的积累）。因此，liWRKY33、liWRKY34、liWRKY48、liWRKY49和liWRKY50是极具潜力的菘蓝品质调控的关键调控因子。 4.从菘蓝表达谱数据库中提取甲基茉莉酸(MeJA，0.5μM)处理条件下菘蓝毛状根中liWRKYs的表达情况，结果发现51个liWRKYs在处理后各时间点(1h、3h、6h、12h、24 h)表现出不同的转录变化，说明liWRKYs广泛参与了MeJA的转录调控。其中liWRKY34和liWRKY50受MeJA诱导，而liWRKY33、liWRKY48和liWRKY49受MeJA抑制。 5.为了进一步筛选与菘蓝落叶松脂素生物合成相关的liWRKY，分别对不同倍性菘蓝（二倍体和四倍体）及MeJA（0.5μM）处理条件下二倍体菘蓝中liWRKY33、liWRKY34、liWRKY48、IiWRKY49和liWRKY50的表达水平和落叶松脂素的含量进行测定，经整合分析，结果发现liWRKY34表达水平与落叶松脂素的积累水平呈正相关，提示liWRKY34是调控菘蓝落叶松脂素生物合成的关键调控因子。该结果为通过植物次生代谢工程提高菘蓝落叶松脂素的含量、获得抗病毒成分高积累的优质菘蓝品系提供了候选基因。 菘蓝木脂素成分生物合成途径关键酶的发现与功能评价:菘蓝落叶松脂素生源途径的阐明为通过激活合成途径提高目标木脂素的含量奠定了基础，然而合成途径涉及多个催化步骤，且每个催化步骤往往有多个拷贝的基因家族成员参与，如何准确选择与目标成分合成最相关的催化酶及基因家族成员作为调控靶点是能否实现高效调控的关键。本论文针对菘蓝木脂素生物合成关键限速步骤不清、基因家族中各成员的贡献度不明的问题，构建“基因—化合物”关联性网络，筛选出了与菘蓝木脂素类成分合成相关的基因，并通过反向遗传学方法以菘蓝松脂醇还原酶家族基因（IiPLR1、IiPLR2和IiPLR3）为对象进行了功能评价，验证了该“基因—化合物”关联性分析的可靠性。最后，对经功能验证的关键调控基因liPLR1进行了系统的表达特征研究、（体外）催化功能研究和（体内）代谢调控研究。具体研究结果如下: 1.通过菘蓝转录组注释，获得了落叶松脂素生物合成途径的编码基因共51个，包含11个催化步骤，每个催化步骤包含若干基因家族成员; 2.从菘蓝表达谱数据库中提取MeJA(0.5μM)处理后各时间点(1h、3h、6h、12h、24 h)菘蓝毛状根中落叶松脂素生物合成途径基因的表达水平变化情况，结果发现51个基因呈现不同的表达响应模式; 3.考察MeJA(0.5μM)处理后各时间点(1h、3h、6h、12h、24 h)菘蓝毛状根中5个木脂素成分（松脂醇、落叶松脂素、开环异落叶松脂素、罗汉松树脂、开环异落叶松脂素二葡萄苷）的积累水平，结果发现它们均受到MeJA诱导，但具有不同的响应模式; 4.将MeJA(0.5μM)处理后各时间点菘蓝毛状根中落叶松脂素生物合成途径基因的表达水平和上述5个木脂素成分的积累水平进行整合分析，描绘“基因—化合物”关联性热图，以皮尔森相关系数0.6为域值(lrl＞0.6)，构建“基因—化合物”关联性网络，共筛选出27个与菘蓝木脂素合成相关的基因，其中7个(IiPAL1、Ii4CL7、liC3H、IiDIR1、IiDIR5、IiDIR9、IiPLR1)与目标抗病毒成分落叶松脂素合成呈正相关; 5.抑制表达IiPLR1显著降低了菘蓝毛状根中落叶松脂素的含量，而抑制表达liPLR2和IiPLR3对落叶松脂素的含量积累无显著影响，说明liPLR1确实是IiPLR家族中唯一对落叶松脂素生物合成具有重要作用的成员，证明了该“基因—化合物”关联性分析结果的准确性; 6.IiPLR1全长cDNA编码317个氨基酸，分子量为35.6 kDa，等电点为5.64。氮(N)端具有NADPH结合域。进化树分析显示IiPLR1与同科植物拟南芥的AtPrR2的亲缘关系最近，氨基酸水平相似度达到85％。IiPLR1在菘蓝根、茎、叶、花中均有表达，根中表达最高;IiPLR1受MeJA、脱落酸(ABA)和紫外(UV)诱导，但具有不同的响应模式;亚细胞定位显示IiPLR1在植物细胞边缘（细胞壁和细胞膜）表达。 7.大肠杆菌表达的IiPLR1融合蛋白能催化松脂醇生成落叶松脂素(Km=63.4μM，Vmax=1.76μM/min，kcat=62.8 min-1，kcat/Km=0.99μM-1 min-1)，并能进一步催化落叶松脂素生成开环异落叶松脂素（Km=2.60μM，Vmax=0.11μM/min,kcat=4.05 min-1,kcat/Km=1.55μM-1 min-1）。 8.过量表达IiPLR1显著提高了菘蓝毛状根中落叶松脂素的含量，与野生型对照WT(56.0μg/g dw)相比，转基因株系ovx-2和ovx-8将落叶松脂素的含量分别提高到353.9μg/g和310.4μg/g，是野生型毛状根WT的约6.3倍和5.5倍，且具有与WT相当的生物量。该研究为以毛状根为生物反应器大规模生产落叶松脂素提供了可行策略，也为通过代谢工程获得落叶松脂素高积累的优质菘蓝品系提供了高效的调控靶点。 综上所述，本论文分别聚焦影响次生代谢产物生物合成的两大类调控因子（转录因子和合成途径基因），挖掘参与菘蓝木脂素类成分生物合成的WRKY转录因子和合成途径基因，并进行功能评价，为通过植物次生代谢工程提升菘蓝（板蓝根）品质提供了候选调控靶点。同时，针对中药（药用植物）普遍存在的遗传背景信息相对薄弱，影响中药品质形成的关键调控靶点大多不明的问题，本论文基于系统生物学思想，整合高通量检测平台，建立了在非模式药用植物中快速确定关键调控因子的研究体系，为中药品质调控研究提供了新思路和方法。