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肺癌是世界上死亡率最高的肿瘤,已经成为威胁人类健康的全球性问题。在中国,肺癌的发病率仍然处于继续升高趋势,男性肺癌占各种肿瘤发病的第一位,女性肺癌占第二位。大部分肺癌患者就诊时候已经处于局部晚期或已经有远处转移,常规的治疗一般是手术、放疗、化疗、生物细胞治疗以及综合性治疗,但效果均不尽人意,于是寻找治疗肺癌的新技术已然成为现今的研究热点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸(Serine/threonine, Ser/Thr)激酶,其基因定位于1p36.2,编码的蛋白质由2549个氨基酸组成,分子量为289kD,因处于信号转导通路的中心环节而备受关注。mTOR在细胞生长、分化以及增殖等基本功能过程中起着中心调节的作用,同时也在调节细胞周期、蛋白质的合成与降解、细胞能量代谢等多种途径发挥着重要的生理功能。因此,mTOR已经成为现今肿瘤靶向基因治疗的热点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指通过一些小的21nt-23nt双链RNA(double strande RNA, dsRNA)或短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)在mRNA水平上高效、特异地阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出其基因缺失的表型的过程。RNAi具有快速、经济、高效、操作简单等特点,其理论及相关技术已经渗透到生命科学的各个领域,在基因功能及疾病的基因治疗方而已被广泛应用。基因治疗的关键因素在于选择最佳的转基因载体、最恰当的目的基因、且能实现目的基因的表达可控性。慢病毒载体可以感染绝大多数细胞,包括分裂期、非分裂期细胞,特别适合于多种细胞的RNAi实验。利用慢病毒载体,可以高效感染细胞,介导外源性基因在细胞中的表达,研究细胞可生长的调控,过表达特定基因的整合,且感染细胞后不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。目的本研究采用RNAi技术,应用化学合成siRNA在人肺腺癌A549细胞中筛选出mTOR基因的高效位点,构建重组慢病毒表达载体,为肺癌的基因治疗探索新的研究方法。方法1.严格按照RNAi设计原则为mTOR基因设计4个干扰位点和阴性对照(Negative control, NC)(FAM)的片段,应用化学合成siRNA有效片段,利用Lipofectamine2000转染试剂转染人肺癌A549细胞,24h后,每日通过荧光显微镜观察人肺腺癌A549细胞中的荧光表达情况,采用RT-PCR和Western-Blot分别检测mTOR基因在24h后mRNA水平和48h后蛋白水平的表达,筛选出高效干扰位点片段再用于慢病毒载体构建。2.针对已经筛选确定的mTOR基因高效千扰位点片段,合成位点片段的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,再与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞中GFP蛋白的表达水平检测病毒滴度并进行活性鉴定。结果1.成功筛选出mTOR基因的siRNA高效干扰位点。2. mTOR siRNA感染人肺腺癌A549细胞,mTOR基因的mRNA和蛋白表达均显著下调。3.成功构建针对mTOR基因的慢病毒siRNA载体,收获病毒上清并检测病毒滴度为1×108UT/ml。结论1. mTOR siRNA感染人肺腺癌A549细胞,引起mTOR基因表达下调。2.成功构建针对mTOR基因的慢病毒siRNA载体。