论文部分内容阅读
在中医药理论中，中医学家认为慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease,CKD）的基本病机特点是“本虚标实，虚实夹杂”，本虚以肺、脾、肾等脏虚损为主，尤其强调肾脏的虚损。标实有风、寒、湿、热、血瘀等，尤以血瘀与湿热为多，其中血瘀证贯穿CKD发生和发展的始终。 因此，传统中医药在CKD的治疗中始终坚持以活血化瘀治疗为主，以神农尝百草的方式经过千年的优化组方，形成了数百种今天临床广泛使用治疗CKD有效的中药方剂。以活血化瘀药物红花与大黄为主组成的方剂和中成药就有数百种（如：肾康注射液、尿毒清颗粒、糖肾II号胶囊、肾衰宁胶囊等），仅“肾康注射液”年销售额已达10亿，这些药物在临床治疗CKD疗效确切，应用广泛，并且大黄中的有效成分大黄酸（Rhein）近来已获批作为治疗糖尿病肾病的中药一类新药即将进入I/II期临床试验，这使得我们有理由确信大黄在中药配伍治疗DN中发挥着关键且不可替代的作用，但大黄-红花活血抗炎、抗氧化应激和抗凋亡损伤的联合保护作用机制不明。 前期，我们在国科金（No.81173514;No.81470174）中，用首创的“药效差示血清色谱法”研究发现，大黄酸（Rhein）及羟基红花黄色素A(HSYA)是红花和大黄的主要有效成分，HSYA具有改变血液流变学、抗氧化、清除自由基及抗细胞凋亡率的作用；Rhein具有抑制脂质过氧化物、清除自由基及抗纤维化的的能力。但是，大黄酸和HSYA单体单用及合用分别在CKD的确切作用及机制尚不清楚。本课题拟在药动学及药效学两方面揭示Rhein–HSYA配伍的内在相互作用机制，为今后含有Rhein–HSYA的方剂和中成药研究提供创新性思路。 目的： 第一部分：大黄酸（Rhein，RH）和羟基红花黄色素A（Hydroxy saffloweryellow A, HSYA）单用及合用改善SD大鼠单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）梗阻模型的药效学实验 建立SD大鼠UUO梗阻模型，通过检测抗炎、抗氧化、抗凋亡相关指标，明确RH和HSYA单用及合用治疗慢性肾病的作用及其机制。 第二部分：阐明RH和HSYA联用在药动学上相互作用规律的实验 运用LC/MS/MS技术，建立体内同时测定RH和HSYA浓度的方法，比较大黄、红花单用及合用后RH和HSYA在大鼠体内的吸收、分布、消除等参数的变化情况，从药动学角度阐明两药合用后的协同作用机理。 方法： 第一部分：药效学实验 1.分组、给药和样本采集：通过SD大鼠单侧输尿管结扎建立慢性肾脏疾病（CKD, Chronic kidney disease）模型，模拟临床的CKD。将30只SD大鼠随机分为对照假手术（sham）组、模型(model)组、RH（rhein）治疗组（100mg/kg/d）、HSYA治疗组（50mg/kg/d）及RH（100mg/kg/d）+HSYA（50mg/kg/d）治疗组，每组6只。SD大鼠UUO手术后连续给药两周，每天一次。两周后处死大鼠，采集肾组织和血样，检测血生化指标肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平，HE染色观察肾组织病理学的变化，进行药效评价。 2.抗炎作用：ELISA法分别检测血清中白介素--1β（Interleukin-1β, IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6, IL-6）、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1, Monocyte chemotactic protein-1)的炎性因子含量，Westrn blot法检测炎症通路相关蛋白NF-kB、IkBα的表达，评价药效物质的抗炎作用。 3.抗氧化作用：试剂盒检测肾组织丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px, glutathione peroxidase)活性变化。 4.抗凋亡作用：TUNEL染色法检测肾组织细胞凋亡情况，Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及caspase-3的表达，并进一步检测了P38MAPK激酶蛋白表达，评价药效物质的抗氧化、抗凋亡作用。 第二部分：药动学实验 取正常SD大鼠18只，体重(250±20g)，适应性饲养一周后，禁食12h，自由饮水，随机分为3组，分别以13.5g·kg-1(0.5％CMC-Na混悬)灌胃量给予大鼠大黄(rhubarb)、红花(safflower)及大黄+红花（rhubarb+safflower，1:1）在给药前5min和给药后2 min,8 min,15 min,30min,45min,1 h,2 h,4 h,6 h,8 h后，进行眼底静脉丛取血(400μL)，肝素钠抗凝，4000r·min-14℃离心l0min，精密量取上清血浆置另一EP管中，-80℃冰箱保存待测。血样经过前处理后，采用液质联用(LC/MS/MS)仪同时测定血浆中RH与HSYA的浓度。测定结果用Phoenix Win-Nonlin5.0.1软件进行分析，以拟合度和AIC值作为判断标准，并且选择适当的房室模型，计算其药动学参数。 结果： 第一部分：药效学实验 1. RH、HSYA单用及两药联用治疗组与模型组相比，均可显著降低大鼠血清中肌酐（Scr）（P<0.05）、尿素氮（BUN）(P<0.05)含量，且联用效果优于单用组；HE染色显示模型组大鼠肾小球结构不完整，大量炎性细胞浸润，治疗组大鼠肾组织病理改变得到明显改善，且联用效果优于单用组。 2.抗炎作用：在UUO大鼠体内，RH和HSYA单用及联用组与模型组相比，均能显著抑制炎症反应，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1因子含量（P<0.05），其机制为抑制NF-kB通路相关蛋白的表达，且两药联用的抗炎作用优于单味药。 3.抗氧化作用：在UUO大鼠体内，RH和HSYA单用及联用组与模型组相比，均能显著抑制氧化应激反应，降低肾组织中MDA含量，升高SOD、GSH活性（P<0.05），且两药联用的抗氧化作用优于单味药。 4.抗凋亡作用：在UUO大鼠体内，RH和HSYA单用及联用组与模型组相比，均可降低TUNEL阳性染色率，抑制肾组织细胞凋亡，其机制为降低损伤的组织中Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，且两药合用的抗凋亡作用优于单味药。进一步研究发现两药合用还能抑制磷酸化的P38蛋白表达，证实了P38级联激酶在UUO模型中被激活，且参与了下游炎症、氧化应激和凋亡反应。 第二部分：药动学实验 在电喷雾离子源ESI(-)离子化条件下，采用多反应监测(MRM)模式分别检测RH(m/z283.8→239.7)、HSYA(m/z611.4→492.0)及内标布洛芬(m/z205.6→161.6）。RH在100.0-5800 ng/mL范围内(R2=0.9977)、HSYA在35.0-3500 ng/mL范围内(R2=0.9986)呈良好线性关系。口服给药后RH及HSYA在大鼠体内符合二室开放模型，两者合用给药后单用和合用给药后，红花中HSYA动学参数具有明显统计学差异。HSYA AUC0–∞值（3087.26±933.73）（P<0.01）及Cmax值(1894.39±942.20)(P<0.05)均显著高于单药组中HSYA AUC0–∞(1694.73±753.28)及Cmax值(301.09±135.73)；而HSYA t1/2z值(3.94±0.68)及MRT0–t值(0.58±0.30)低于单药组中HSYA t1/2z值(5.08±2.54)及MRT0–t值(0.71±0.19)；相应的，RH AUC0–∞值(7167.861±3108.36)Cmax值(3250.12±1416.18)高于单药组中RH AUC0–∞值（7121.855±4241.50）（P>0.05）及Cmax值(2732.97±1905.99)（P>0.05）。 结论： 第一部分：药效学实验 1.大黄酸和羟基红花黄色素A联用比单用具有明确的改善肾组织损伤的作用。 2.大黄酸和羟基红花黄色素A联用比单用发挥更好的抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡的作用。 3.大黄酸和羟基红花黄色素A联用通过阻止P38MAPK和NF-kB信号通路保护UUO损伤的肾组织。 第一部分：药效学实验 1.本文首次建立了同时测定体内大黄酸和羟基红花黄色素A的方法，通过药动学实验分析大黄、红花单用及合用后体内大黄酸和HSYA药动学变化，结果表明，两药合用后大黄中的大黄酸可显著影响红花中HSYA的吸收、分布、消除和代谢，具有明显的药动学相互作用，提示两药合用协同抗炎抗氧化及抗凋亡的机制与两药相互促进吸收有关。