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第一部分4-AP对人精子运动和顶体反应影响的研究 目的：检测不同浓度4-AP对人精子运动参数和HA的影响，筛选合适的4-AP浓度进行实验，评估4-AP诱导人精子HA的能力并检测4-AP对人精子AR及MMP的影响。 方法：按照第五版人类精液检验与实验室处理手册中的正常精液标准，检测从湖北省人类精子库收集到的标本，合格的标本纳入实验，利用密度梯度离心法优化精液标本。 （1）用不同浓度4-AP（1mM、2 mM、4 mM）与等体积优化后的精子悬液混合，处理5min、15min、30min、60min时用CASA分析精子各运动参数，捕捉精子运动轨迹图形，用于后期计数HA精子比例； （2）用2 mM4-AP、100uM IBMX分别与等体积优化后的精子悬液混合，处理0min、5min、15min、30min、60min时用CASA分析精子各运动参数，捕捉精子运动轨迹图形，用于后期对4-AP诱导人精子HA能力的评估； （3）考马斯亮蓝染色法检测4-AP诱导人精子AR的能力，分别于4-AP处理15min、30min、60min时检测； （4）伊红Y染色，评估4-AP处理后人精子的活率，检测时间点为4-AP处理0min、5min、15min、30min、60min，并使用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测精子MMP变化，检测时间点为4-AP处理0min、15min、30min、60min。 结果： （1）不同浓度4-AP均能明显降低人精子的STR、LIN、VCL、VSL、VAP及PR，升高人精子的ALH和BCF；1mM4-AP作用较弱，在药物处理15min后VCL开始降低，STR、VSL、VAP的降低则出现在药物处理后30min，而2mM及4mM4-AP在处理5min时即发挥出作用；不同浓度4-AP均能在处理5min时升高人精子HA比例，可持续至60min，并在15min时HA达到高峰；本反应体系中，2mM4-AP诱导人精子HA能力较1mM和4mM强，分别是它们的2.19倍、1.31倍；4-AP处理人精子5min后活力开始降低，随时间延长进一步降低，60min时活力降到53.16%、46.40%、41.86%； （2）4-AP及IBMX均能降低人精子的LIN、PR，但4-AP降低LIN的能力强于IBMX；4-AP降低人精子STR、VSL、VAP，升高人精子ALH，而IBMX对这些参数无明显影响；4-AP及IBMX诱导人精子发生HA，但IBMX的诱导作用较弱，各时间点的HA比例均低于4-AP组；4-AP处理人精子15min后HA比例最高，其最大诱导能力约为IBMX的5.16倍； （3）4-AP处理人精子15min即可诱导其发生AR，30min后趋于平稳；（4）2mM4-AP处理精子后，精子活力明显降低但其活率并没有发生变化，并在处理15min时升高人精子MMP。 结论： （1）不同浓度4-AP均能诱导人精子发生HA，但是2mM4-AP诱导HA的能力最好，并且强于IBMX； （2）首次验证出4-AP可以诱导人精子发生AR； （3）4-AP降低精子活力但不影响精子活率，并在HA精子比例最高时升高人精子MMP。 第二部分不同黏稠环境中4-AP对人精子运动作用差异的研究 目的：筛选适合人精子体外培养的MC浓度，检测不同黏稠环境中精子运动差异以及不同黏稠环境中4-AP对人精子的作用。 方法： （1）用含0.9%HSA的F-10培养液配制10mg/ml MC溶液和5mg/ml MC溶液，取不同浓度MC溶液加入等体积优化处理后的精子悬液，CASA检测精子活力； （2）取5mg/ml MC溶液和F-10培养液，分别与等体积精子悬液混合，于5min、15min、30min、60min用CASA检测，并截图保留精子运动轨迹，分析两种环境中精子运动参数差异； （3）精子悬液分别与等体积MC溶液、4-AP溶液、含4-AP的MC溶液混合，于5min、15min、30min、60min用CASA检测，并截图保留精子运动轨迹，分析不同环境中精子运动参数差异。 结果： （1）5mg/ml MC中精子活力良好，可以在黏稠环境中维持60min，10mg/ml MC中精子活力在5min时即明显降低，活力不能够维持至60min；（ 2）MC生成的黏稠环境升高精子STR、LIN，降低VCL和ALH，与对照组相比各时间点均有显著性差异，黏稠环境中VAP、BCF降低，60min时与对照组表现出差异，VSL和motility虽有下降，但与对照组无差异； （3）与黏稠环境相比，在黏稠环境中加入4-AP后，精子STR、LIN、VCL、VSL、VAP降低，ALH和BCF升高；在同等浓度4-AP作用下，黏稠环境中的精子VCL、VSL、VAP和ALH均较非黏稠环境显著下降，STR和LIN升高，黏稠环境中加入4-AP后精子没有出现过度活跃运动，仍以直线运动为主。 结论： （1）5mg/ml MC生成的黏稠环境属于适合人精子体外培养的黏稠环境，使人精子表现出明显的前向性和直线性运动； （2）首次在不同黏稠环境中研究4-AP对人精子的影响，4-AP在非黏稠环境中使精子表现出不规则的HA运动；黏稠环境中加入4-AP后精子仍呈现直线运动，说明不同黏稠环境中精子HA运动表现不同。 第三部分4-AP影响人精子运动的机制探讨 目的：研究4-AP对人精子胞内Ca2+的影响，并对不同黏稠环境中4-AP作用差异的机制进行探讨。 方法：取优化处理后的精子悬液500ul加入2.5ul1mM Fluo-3 AM共孵育30min后，离心去上清，500ul新鲜F-10培养液重悬精子。空白组、4-AP组、MC组和MC+4-AP组分别加入重悬的精子悬液处理15min后，离心弃含药上清，再用适量新鲜F-10培养液重悬精子，用流式细胞仪检测精子胞内Ca2+浓度变化，荧光显微镜检测精子胞内Ca2+定位。 结果：无论在非黏稠环境还是黏稠环境，4-AP均能够明显升高人精子胞内Ca2+浓度，并且4-AP升高人精子胞内Ca2+的能力无差异。 结论：4-AP通过升高人精子胞内Ca2+浓度影响精子各运动参数并调控精子HA的发生，不同黏稠环境中精子运动方式的差异，可能是Ca2+和黏稠环境共同作用的结果。