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实验目的: 本文的主要研究内容是利用转座子介导的碱基交换突变方法(TDEM)构建一个饱和的HIV-1整合酶随机突变库，然后利用这个突变库筛选耐受已上市的属于整合酶链转移抑制剂(INSTI)的雷特格韦和在初级研发阶段的属于变构整合酶抑制剂(ALLINI)的BI-D，KF116的突变株。 实验方法: 1.为了构建一个突变覆盖整合酶上所有氨基酸位点的随机突变库，我们使用了TDEM方法，造成目的基因连续三个碱基的替换，在目的蛋白中造成单个氨基酸或连续两个氨基酸的突变。这种方法兼具随机突变可以在一轮突变产生成千上万个随机突变的优点和定点突变可以控制突变类型的特点。 2.为了筛选出可以耐受整合酶抑制剂的HIV-1突变株，我们将构建的整合酶突变库克隆到含有HIV-1基因组的质粒pNL4.3上，通过转染293T细胞得到含有整合酶突变库的HIV-1，并在药物存在下，感染CEM细胞，筛选出耐药突变株。我们分别使用了Sanger测序和二代测序两种方法确定筛选的突变株的序列，并通过与野生型HIV-1整合酶的序列进行比对，识别出耐药性突变。分析二代测序结果时，某个突变在筛选后突变库中的频率与其在输入突变库中频率的比值，简称为FC。 实验结果: 1.通过TDEM，我们构建了一个突变位点能覆盖整合酶（288个氨基酸）全部氨基酸残基的随机突变库，库的多样性覆盖了理想突变库多样性5472(288x19)的65.8％。 2.含有整合酶突变库的HIV-1与CEM细胞分别在雷特格韦（20nM和40nM）、BI-D（200nM和400nM）和KF116(50nM)存在下共培养，得到了耐受该药物的病毒突变库。雷特格韦筛选之后的病毒库的二代测序结果显示，已报道的大多数主要初级耐药突变在二代测序中得到FC都大于1，还识别到E35K，C56G，Q221K等未报道的耐药突变。400nM BI-D的筛选条件下，二代测序得到了的C56G，G82E，G272E等未报道的突变。Sanger测序得到的50nM KF116筛选到的突变集中于T124，T125两个氨基酸，与其他文献报道的耐药突变位点一致。 实验结论: TDEM方法可以构建一个在饱和的整合酶随机突变库，并且利用含有这个突变库的HIV-1病毒库，可以筛选出对于耐药性有重要贡献的氨基酸残基。结合Sanger测序和二代测序的测序结果，我们发现雷特格韦的已报道的大部分主要初级耐药突变在筛选后的突变库中可以鉴别到，证明了利用本突变库筛选耐药突变的可行性。另外我们还识别到一些并未报道的比较有趣的位点，我们选取了其中五个从未报道过的突变进行耐药性的验证。由于毕业年限限制，这五个突变已经通过定点突变PCR获得，但是还未完成细胞实验部分。