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宠物犬作为常见的伴侣动物,其健康问题一直倍受重视。随着现代医疗水平的提高,宠物犬的寿命得以有效延长,但伴随着环境等刺激因素的增加,肿瘤已成为危害犬只生命的一大杀手。肿瘤是动物机体内遗传物质改变造成细胞增殖、分化过程失控而形成的病理性赘生物,分为良性和恶性2种基本类型。影响犬肿瘤发病的因素很多,如动物品种、年龄因素导致的免疫功能下降和内分泌失调,饲养环境中的各种理化刺激等,均可导致肿瘤的发生。在宠物犬肿瘤疾病中,乳腺肿瘤在雌犬肿瘤疾病的占比较大,临床发病率达肿瘤病例总数的50%或以上,且其中半数表现为恶性乳腺肿瘤。犬乳腺肿瘤具有与人类乳腺肿瘤极为相似的分子生物学特征与临床特点。因此,犬是用于肿瘤比较医学研究的理想动物模型。p53与PTEN作为肿瘤的特征性表达分子,是人类肿瘤中突变率最高的2个抑癌基因,受到广泛的关注。p53和PTEN曾用于多项人类癌症风险的检测和诊断,并用于进行疾病的预后及肿瘤复发的监测,但两者联合应用于犬乳腺肿瘤的预后迄今尚未见报道。本试验通过对犬肿瘤发病情况的临床分析,针对发病率最高的犬乳腺肿瘤的特征性分子表达进行研究,旨在分析p53和PTEN在宠物犬乳腺肿瘤的表达特征与规律,以期为临床诊断及预后提供试验依据。期望所获结果不仅对小动物医学具有临床参考价值,也通过与人类医学相关研究的比较,为肿瘤疾病的诊疗提供参考。研究结果如下:1.宠物犬肿瘤的临床病理学特征与发病分析66例犬肿瘤临床病例来自南京地区多家宠物医院。肿瘤患犬血常规指标中淋巴细胞常表现为升高,单核细胞与中性粒细胞减少。良性和恶性犬肿瘤各有不同的临床表现:良性肿瘤除局灶性肿块外,对机体功能的影响有限,患犬一般无明显的全身症状;恶性肿瘤由于经常出现转移、发炎等现象,临床症状更为明显,患犬精神不佳、饮食减少,并往往伴有器官功能障碍。X光检查在头部、腹腔和体表肿瘤性质的辅助诊断中较为重要。分析表明,门诊犬肿瘤主要有8个临床发病部位:其中乳腺肿瘤发病率45.5%、皮肤及肛周肿瘤发病率16.7%,分列前2位;之后依次为软组织(13.6%)、口腔(7.6%)、阴茎睾丸(6.1%)、子宫及卵巢(4.5%)、淋巴系统(4.5%)和膀胱(1.5%)。小型犬肿瘤发病居多(62.1%),其中贵宾犬占比最大(21.2%)。不同品种犬的常发肿瘤部位及类型也有不同,小型犬常见乳腺肿瘤,中大型犬发生软组织、口腔肿瘤比例更高;患犬年龄从10月龄至17岁不等,平均发病年龄9.4岁;中老年犬仍为主要的发病群体,但肿瘤的低龄化趋势也不容忽视。不同品种的发病年龄也有差异;部分肿瘤发病受性别及绝育状况等的影响;饲养管理情况也与肿瘤发病率相关。2.犬乳腺肿瘤的临床与组织病理学分析30例乳腺肿瘤患犬的临床与组织病理学分析表明,小型纯种犬为乳腺肿瘤的主要发病群体(90.0%),贵宾犬排名第一(33.3%)。患犬的年龄分布主要在8-13岁(80.0%),未见4岁以下及15岁以上的病例。肿瘤大小影响肿瘤类型,直径3-5 cm的乳腺肿瘤恶性占比达81.8%。经组织病理学分析,确诊12例良性肿瘤(40.0%)和18例恶性肿瘤(60.0%),良性肿瘤按发病率由低到高依次为腺瘤、纤维腺瘤和乳头状瘤,恶性肿瘤由低到高依次为导管内乳头状癌、混合癌和浸润性癌,其中浸润性癌(33.3%)是犬乳腺肿瘤中发病率第一的类型。3.犬不同类型乳腺肿瘤p53和PTEN mRNA的表达25例样本(包括2例正常乳腺组织对照)分为4组(正常对照组,良性肿瘤组,临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的低恶性肿瘤组和临床分期Ⅳ、Ⅴ级的高恶性肿瘤组)用于RT-PCR检测p53及PTENmRNA表达分析。p53与PTEN基因在犬乳腺组织的表达与肿瘤恶性程度呈现截然相反的变化;p53表达随恶性程度的上升而升高,良性、低恶性、高恶性肿瘤组p53相对表达中位数分别是2.45、2.58和3.79,均与对照组正常乳腺有明显差异(P<0.05)。低恶组四分位间距较大(2.06)说明组内表达情况离散;良性组与高恶组、低恶组与高恶组间差异显著(P<0.05)。PTEN在各肿瘤组中的mRNA表达均较正常对照组出现显著下降(P<0.05)。良性组相对表达量中位数为0.45,第三四分位数达到0.67,组内离散情况为4组中最高。低恶性组中位数下降为0.18,高恶性组整体表达水平最低,但中位数稍高于低恶性组达0.21,各肿瘤组间差异不显著。4.犬不同类型乳腺肿瘤p53和PTEN蛋白的定位与表达28例有效样本(包括2例正常乳腺组织对照)按上述分组用于Western Blot分析,检测p53和PTEN蛋白的表达。p53在53 kD处出现特异性条带,PTEN在54 kD处出现特异性条带。良性、低恶性和高恶性组p53/β-actin相对表达强度分别为2.73 ±0.33、2.93 ±0.37和4.01 ±0.39,p53蛋白在各组肿瘤组织的表达逐步升高,肿瘤各组与正常组均有显著差异(P<0.05)。PTEN表达趋势与p53相反,由正常对照组到高恶性组表达量明显下降(2.37 ±0.14、0.71 ±0.05、0.53 ±0.03 和 0.27±0.04;P<0.05)。用免疫组织化学(IHC)法对32例样本(2例正常对照、30例肿瘤)的p53和PTEN蛋白进行定位检测,发现p53主要在细胞核内表达,整体阳性率62.5%,在恶性肿瘤表现为过表达;PTEN蛋白在胞质的着色居多,恶性组织中表达率下降,总体失表达率达到56.2%。5.p53和PTEN表达与犬乳腺肿瘤临床发病的关系为了解p53和PTEN蛋白表达与不同的临床病理特征的联系,对肿瘤患犬年龄、瘤体大小、肿瘤分期分级等特征进行分析。结果发现,p53表达与乳腺肿瘤的大小显著相关,3-5 cm直径肿瘤的p53阳性率最高;PTEN表达随肿瘤临床分期升高逐级下降明显,两者间呈显著的负相关(r=-0.367,P<0.05)。预后研究表明,p53阴性表达及PTEN阳性表达患犬具有更好的术后效果。