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目的:通过体内外实验研究维生素E琥珀酸酯(Vitamin E succinate,VES;α-tocopheryl succinate,α-TOS)对结肠癌细胞增殖、凋亡、细胞周期以及相关蛋白表达的影响,进一步探讨VES的抗结肠癌作用机制,为结肠癌治疗及化学预防提供理论依据。方法:1体外实验:体外培养人结肠癌细胞(SW480),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度VES作用于该细胞24h、48h、72h后的增殖抑制情况;流式细胞术(FCM)测定VES对SW480作用48h后的细胞周期分布和凋亡率;应用光学显微镜及透射电镜观察细胞形态改变;采用流式细胞术半定量检测VES处理后细胞Fas、bcl-2及PCNA蛋白的表达水平。2体内实验:将60只雄性BALB/c小鼠随机分为5组,每组12只。将鼠结肠腺癌细胞(colon26)接种于各组小鼠右腋皮下,形成小鼠结肠腺癌移植瘤模型。对照组给予芝麻油0.05ml/只,腹腔注射,每天一次,共两周;VES低、中、高剂量组分别给予VES 25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg腹腔注射,每天一次,共两周;5-Fu组给予5-Fu 3.3mg/只(0.2ml),腹腔注射,每周一次,共两周。于用药结束后次日处死各组小鼠,剥瘤称重,计算抑瘤率;取脾称重,计算脾指数;流式细胞术检测各组肿瘤组织细胞周期分布及凋亡率;免疫组化法检测各组肿瘤组织Fas、PCNA及bcl-2的蛋白表达情况。结果1体外实验结果1.1 VES抑制SW480细胞增殖:MTT法结果显示5、10、20、40、80μg/ml VES处理细胞24～72h后,各处理组OD值均有不同程度下降,与对照组相比,有极显著性差异(P<0.01)。各实验组间比较,亦有极显著性差异(P<0.01)。且随药物浓度的增大、作用时间的延长,VES各组OD值逐渐下降,抑制率升高,即VES对SW480细胞的增殖抑制作用呈明显的时间-剂量依赖效应。1.2 VES可诱导SW480细胞周期阻滞和凋亡:流式细胞仪检测结果显示10、20、40μg/ml VES作用于SW480细胞48h后,随药物浓度增加,G0/G1期细胞比例增加、S期比例下降、增殖指数PI明显下降(Ρ<0.01), VES可阻滞SW480细胞周期进程于G0/G1期,且该作用呈剂量依赖性。VES各剂量组凋亡率分别为:8.50%、14.30%、35.76%,对照组凋亡率为1.39%,各处理组与对照组相比均有极显著性差异(P<0.01)。1.3 VES对SW480细胞形态的影响:光镜下观察细胞形态发现:正常对照组细胞呈菱形或梭形,形态饱满,而VES(20μg/ml)处理48h后的细胞密度极其稀少,体积变小,细胞皱缩,破裂,呈不规则形,有的细胞两端出现细长的伪足,细胞胞浆中出现空泡,脱落细胞增多。透射电镜下观察,VES处理后的细胞呈现不同程度凋亡性改变:细胞体积缩小,胞质可见空泡变性,核染色质高度浓缩,电子密度增高,边集于核膜下,形成沿核膜收缩的新月型小体,有的出现核固缩及核碎裂。1.4流式细胞仪半定量检测SW480细胞Fas、bcl-2及PCNA蛋白表达:10、20、40μg/ml VES作用于SW480细胞48h后,发现Fas蛋白的荧光指数(FI)随VES浓度增大而增大,PCNA、bcl-2蛋白的FI值则随药物浓度的增大而逐渐减小。对于每一种蛋白,其处理组和对照组FI值比较,均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。2体内实验结果:2.1 VES可抑制小鼠肿瘤生长:VES低、中、高剂量组对小鼠colon26移植瘤的抑制率分别为:14.55%、34.79%、50.96%,呈剂量依赖性。5-Fu组抑制率为62.93%,高于VES各处理组。各组小鼠处死前的体重比较:VES各处理组与对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。5-Fu组小鼠的体重明显低于对照组,有极显著性差异(P<0.01)。2.2 VES低、中、高剂量组及5-Fu组荷瘤小鼠的脾指数分别为:12.403±1.749、12.967±1.212、14.868±1.607、5.058±1.816,VES各组与5-Fu组相比均有极显著性差异(P<0.01)。2.3 VES可阻滞瘤组织细胞周期及诱导凋亡:流式细胞分析仪检测结果显示VES低、中、高剂量组瘤组织细胞的G0/G1期细胞比例增加、S期比例下降,与对照组相比均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。VES各剂量组肿瘤细胞的凋亡率分别为:15.99%、20.80%、39.71%,对照组为5.38%,VES各组与对照组相比均有极显著性差异(P<0.01)。5-Fu组凋亡率为51.65%,VES高剂量组凋亡率低于5-Fu组(P<0.01)。2.4免疫组化法检测肿瘤组织细胞Fas、bcl-2及PCNA蛋白表达:按照IHS值法进行免疫组化评分。VES各组Fas蛋白表达值(IHS值)随VES浓度增大而增大,bcl-2、PCNA蛋白表达值则随药物浓度的增大而逐渐减小。三种蛋白各自比较其处理组和对照组的表达值,均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结论1 VES在一定剂量范围内可抑制结肠癌细胞SW480增殖,并呈剂量和时间依赖性。2 VES在一定剂量范围内可抑制小鼠结肠癌移植瘤的生长并呈一定的剂量依赖性,VES可提高荷瘤小鼠的脾指数。3 VES可诱导结肠癌细胞凋亡,将细胞阻滞于G0/G1期,该作用呈剂量依赖性。4 VES具有抗结肠癌作用,其机制可能与上调Fas、下调bcl-2及PCNA蛋白的表达有关。5本实验结果显示:VES具有抑制结肠癌细胞增殖、诱导凋亡及阻滞细胞周期的作用,为其用于结肠癌治疗及化学预防提供了新的思路和理论依据。