论文部分内容阅读
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是广泛存在于细胞膜和细胞基质中的一类生物大分子，主要由一核心蛋白通过共价键形式与硫酸肝素糖链相连而成。HSPG作为生长因子的共受体(co-receptor)在肿瘤增殖、分化、侵袭和转移等一系列过程中担任重要角色。然而，HSPG的调控机制目前还不清楚。microRNA(miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，它通过核酸序列的互补性结合到特定的靶mRNA的3’UTR区，导致转录后翻译抑制，从而调控靶基因的表达和功能。miRNA广泛参与肿瘤的增殖、侵袭、迁移和血管生成等过程。我们推测miRNA可能通过两种方式在HSPG生物过程中发挥作用：1.参与了HSPG合成和降解酶相关基因的调控；2.受到HSPG调控，在HSPG各种信号通路中调控重要分子，从而在HSPG整个网络中发挥介导作用。为了证明我们的推论，我们开展了以下三部分的工作：
第一部分 HSPG合成和降解酶相关基因与miRNA调控机制的研究
首先，我们应用研究miRNA与靶基因相互作用的“金标准”--双报告基因荧光素酶系统来研究miRNA对HSPG合成和降解酶相关基因的调控。我们发现miR-218，miR-25，miR-32，miR-367可以抑制Syndecan-2；miR-200a和miR-330可以抑制Sulf-2；miR-125a和miR-125b可以抑制Glypican-4的表达，miR-99a可能参与3-OST-2的表达调控。接着，我们用RT-PCR检测了部分双报告基因荧光素酶方法的结果，证实了miR-200a和miR-330可以抑制Sulf-2的表达。
肝素酶(Heparanase)是一种特异性地作用于HSPG糖链中GlcA和GlcN之间的糖苷键的糖苷内切酶，可以通过降解HSPG糖链在肿瘤发生过程中发挥重要作用。我们利用microarray检测了过表达Heparanase的细胞株中miRNA表达变化情况，发现过表达Heparanase后miR-222，miR-221，miR-20b，miR-106a，miR-17，miR-20a发生下调，而miR-638则上调。这些miRNA表达变化在TaqManReal-time PCR的实验中也得以证实。我们的研究首次表明miRNA在细胞生长和发展过程中可以调控HSPG的动态平衡，为进一步研究具体作用机制打下了基础。
第二部分 Heparin通过miR-10b抗血管生成作用机制研究
为了进一步研究miRNA是否受到HSPG调控，我们探讨了HSPG糖链类似物肝素(Heparin)对miRNA的影响。Heparin作为临床上广泛使用的抗凝药物，其抗肿瘤活性也被文献所报道。已有研究表明heparin抑制肿瘤生长和转移复发与其能够抗血管生成密切相关，但机制有待进一步明确。我们的研究表明heparin可以通过抑制miR-10b的表达，从而最终发挥抑制血管生成作用。具体如下：miR-10b能够在体外促进HMEC-1细胞迁移和管腔形成。反之，应用anti-miR-10b抑制其表达则能抑制血管生成。Rescue实验表明恢复miR-10b表达水平后，HMEC-1细胞的管腔形成也能够恢复到正常水平。进一步体内实验也证明miR-10b能够促进血管生成。接着，通过双报告基因荧光素酶系统研究我们发现miR-10b的靶分子是HoxD10，siRNA沉默HoxD10也能促进血管生成。Heparin在体外能够抑制HMEC-1细胞迁移和管腔形成，在体内能够抑制裸鼠乳腺癌移植瘤中miR-10b的表达，促进HoxD10的表达而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。我们进一步研究发现这一过程与凝血酶(thrombin)密切相关，siRNA沉默thrombin后，heparin的抑制效果也消失。进一步研究表明thrombin可以诱导miR-10b转录因子twist的表达从而促进miR-10b的表达进一步下调HoxD10的表达。QCM实验证明heparin可以和thrombin结合，进而逆转thrombin的功效起到抑制miR-10b的表达。综上所述，我们研究表明miR-10b参与了heparin的生物活性过程，表现为heparin可以和thrombin结合，抑制miR-10b转录因子Twist的表达，从而抑制miR-10b的表达，上调HoxD10的表达，从而抑制血管生成。这些研究为肝素影响血管生成的作用机制研究提供了一条新的通路，也为高凝状态下肿瘤血管生成过程中的机制研究提供了新的思路。
第三部分 MicroRNA-149促进神经胶质瘤生长作用机制研究
文献报道Glypican-1在神经胶质瘤中的表达常常是上调的，它能够增强FGF2在神经胶质瘤中的信号传导。我们发现miR-149位于Glypican-1基因的第一个内含子中。一般来说，miRNA基因与内含子的转录方向是一致的，即位于内含子内的miKNA大多是与该基因共转录的。但miR-149在神经胶质瘤中的作用机制还未见报道。为此，我们系统的研究了miR-149在神经胶质瘤中的作用，以期发现Glypican-1新的作用机制。
首先我们利用组织芯片分析了miR-149在72例神经胶质瘤组织标本和10例正常脑组织中的表达，发现miR-149在神经胶质瘤组织中有较高的阳性表达率，提示miR-149可能与神经胶质瘤密切相关。为研究其功能，我们利用慢病毒载体过表达miR-149，发现过表达miR-149能促进脑胶质瘤细胞生长和抗凋亡能力，而利用寡核苷酸anti-miR-149抑制miR-149的表达则能抑制细胞增殖。接着，分析细胞周期，我们发现过表达miR-149促进了细胞G1/S期的转化。为研究miR-149的靶标，我们首先利用双报告基因荧光素酶系统进行筛选，发现miR-149能够结合到Caspase-2的mRNA的3’UTR上，抑制荧光素酶的表达；而anti-miR-149则能上调荧光素酶的表达。进一步研究表明过表达miR-149抑制了Caspase-2的表达，而寡核苷酸抑制miR-149的表达则能上调Caspase-2的表达。siRNA沉默Caspase-2后也能提高抗凋亡能力，这与过表达miR-149的作用是一致的。上述结果表明Caspase-2是miR-149的发挥生物功能的靶标。接着，我们分析了miR-149的信号通路。我们发现miR-149抑制Caspase-2表达进而抑制p53通路中多个关键基因(如p53，p21，Cdc-2)，使细胞G1/S期转化增快。体内裸鼠成瘤实验结果也表明miR-149能抑制Caspase-2的表达而促进神经胶质瘤生长。综上所述，我们的实验结果提示miR-149可能在脑胶质瘤的发生过程中起着重要的作用，并可能作为脑胶质瘤临床诊治的一个潜在的新靶点。而miR-149是否与Glypican-1一起发挥协调作用，还需进一步阐明。
综上所述，我们的研究表明一些miRNA在HSPG生物过程中发挥作用；
1.MiRNA可以调控HSPG合成和降解酶相关基因；
2.HSPG合成和降解酶相关基因也能调控一些miRNA；
3.一些miRNA介导HSPG的功能，如miR-10b参与了heparin的抗血管生成，抑制肿瘤生长；
4.HSPG的已知功能可以为研究miRNA功能提供线索，如我们发现位于Glypican-1基因的第一个内含子中的miR-149通过抑制Caspase-2的表达而促进神经胶质瘤生长。