【摘 要】
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随着基因工程技术的发展,基因治疗尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注.人们构建了各种基因治疗载体,重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一.293细胞是在重组腺
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随着基因工程技术的发展,基因治疗尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注.人们构建了各种基因治疗载体,重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一.293细胞是在重组腺病毒的生产过程中常用的包装细胞之一.能否生产出大量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素.为了满足体外和临床实验的需要,本论文针对293细胞包装体系生产Ad5-IκBαM重组腺病毒载体进行了以下几个方面的研究.1、293细胞的生长特性.实验发现293细胞贴壁能力很弱,对乳酸的耐受性很好;对搅拌速度非常敏感,所以,在微载体培养时,接种后前2h采用间歇搅拌,2h后控制搅拌速度在20r/min.2、摸索了293细胞批式和灌注培养的生长与代谢.在方瓶和搅拌瓶批式(微载体浓度为6g/L)培养条件下,检测了葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸的代谢.在此基础上设计了间歇式灌注培养的方案,间歇灌注培养最终细胞密度达到了批式培养的三倍.根据293细胞生长特性,在Logistic模型的基础上,建立了描述批式和灌注微载体培养的293细胞生长模型,模型同实验结果符合很好.3、对Ad5-IκBααM的生产工艺进行了优化.确定了病毒的最佳接种量为MOI=8,血清浓度为10％,pH=7.2,接毒时间为对数生长中后期,接毒后40h收获病毒.采用MUSTANG Q膜层析系统对重组腺病毒的纯化进行了初步的探讨,该方法有效的减少了纯化的步骤,从而降低了纯化过程中Ad5-IκBαM的损失.4、为了降低贴壁依赖性细胞规模培养的成本,本论文探索了293细胞培养过程中的Cytodex-3的回收工艺.实验结果表明经回收处理后的微载体可以很好的支持293细胞的生长.比较了细胞在回收的、新的和胰酶处理后的微载体上的生长规律.发现前两者的生长代谢规律十分相似.细胞在胰酶处理后的微载体上的生长则受到了很大的影响.
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