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由香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上重要的病害之一,在世界上许多香蕉种植区都有发生,在我国成为了限制香蕉生产和发展的最主要限制因子。目前,利用抗病品种是控制该病最经济和有效的措施,而揭示香蕉抗枯萎病的生化机制,研究病菌与寄主之间的互作,可以为抗病育种和香蕉枯萎病的防治提供重要的理论基础。
植物的抗病生理生化机制复杂。植物体内正常情况下防御酶系统处于平衡状态,而受病原物侵染后活性大大改变。本研究以新选育出的抗病品种粉杂一号和感病品种广粉一号为研究材料,比较香蕉被病菌侵染后不同抗性品种接种前后一些防御酶的差异,探索这些因子与抗枯萎病的关系,结果表明:(1)过氧化氢酶(Catalase,CAT):未接种处理的抗感品种中,其CAT活性均表现为缓慢上升,且两品种之间差别很小。而接种后,感病品种酶活只在第1 d和第2 d略微上升,活性略高未接种;而抗病品种酶活则迅速上升并出现两次峰值,分别出现在第1 d和第3 d,峰值酶活显著高于对应感病品种酶活及自身未接种植株对应酶活。由此可以看出,接种后,CAT活性增幅的大小和次数与品种抗病性水平具有相关性。(2)过氧化物酶(Peroxidase,POD):未接种处理的抗感品种中,其POD活性均表现为先上升后下降,并均在第2 d达到峰值且两品种峰值酶活差别很小。而接种后,抗感品种POD活性均迅速上升并在第2 d达到峰值。抗病品种比感病品种在峰值的酶活更高,增幅更大由此可以看出,接种后,POD峰值活性的大小及增幅与品种抗病性基本正相关。(3)多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO):未接种处理的抗感品种中,其酶活随时间均缓慢上升,感病品种在第5 d下降随后又上升;而接种后,感病品种酶活在第2 d天出现一个峰值而后下降,峰值酶活是未接种植株对应酶活的1.2倍;而抗病品种酶活则迅速上升,从第二天开始酶活出现高峰并保持一定的稳定性,峰值酶活显著高于对应感病品种酶活及自身未接种植株对应酶活。由此可以看出,接种后,抗感品种接种与未接种酶活峰值的增幅及出现的早晚和稳定性,与品种的抗病性程度相吻合。(4)超氧化物歧化酶(Superoxidase,SOD);未接种处理感病品种,其SOD酶活随时间均缓慢上升,抗病品种的酶活基本保持不变;接种后,感病品种酶活仍随时间均缓慢上升;而抗病品种酶活则略微上升后下降。由此可以看出,接种与否对感病品种酶活影响极小,抗病品种酶活却出现轻微变化,但酶活总体变化与抗病性之间关联性不大。以上结果证明了包括CAT,POD和PPO在内的防御酶系活性的高低可以作为判断香蕉品种对枯萎病菌抗性的一个重要生理指标,而SOD与品种抗病性之间的关系则需要进一步研究。这为揭示香蕉与枯萎病菌相互作用及其病理生理机制打下坚实的基础。
本研究首次将绿色荧光蛋白(GFP)基因利用农杆菌介导法转化进香蕉枯萎病菌1号小种和4号小种中,通过PCR及Southern杂交验证,证明目的基因已成功转入病菌基因组中。得到了可以发出强烈绿色荧光的4号小种和1号小种的转化子,接种到相应的寄主上发现致病力没有发生改变。将转化子在无潮霉素B选择压力下连续转接5代,再转接到含潮霉素B的PDA培养基上,这些转化子仍能正常生长,且经过荧光显微镜检测均可以发出强烈的荧光,进一步表明GFP基因已经整合到两小种转化子的基因组中,能够稳定遗传。这为进一步研究该病菌与寄主以及其他生物之间的互作奠定了坚实的基础,也为研究香蕉在组织形态方面抗枯萎病的机制奠定基础。
同时构建了适用于该方法的双元表达载体pBHt1-sGFP,证明了启动子Pgap和PgpdA均能成功启动HygB抗性基因的表达,因此可以推测也能够成功启动其他外源蛋白的表达,间接证明了SGFP比EGFP能更好的表达GFP基因,为异源蛋白在香蕉枯萎病菌中的表达提供了理论基础及借鉴意义。