论文部分内容阅读
作为最原始的无颌类脊椎动物,日本七鳃鳗(Lampetra japonica)是研究免疫起源与进化的重要模式生物[1]。STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)是重要的信号转导与转录因子,参与细胞多种生理过程。研究显示,日本七鳃鳗L-STAT3可通过上调表达应答七鳃鳗肠道希瓦氏菌(Shewanella sp.)免疫,因此推测L-STAT3参与了七鳃鳗适应性免疫调控的过程。关于日本七鳃鳗L-STAT3的研究目前还未见报道,因此L-STAT3的功能研究可为分析七鳃鳗应答肠道共生菌免疫刺激的适应性免疫过程提供理论基础。基于此,本论文的具体研究内容如下:1、日本七鳃鳗白细胞应答希瓦氏菌免疫刺激差异表达蛋白质组的鉴定本研究利用Label-free定量蛋白质组学技术鉴定了日本七鳃鳗白细胞应答肠道希瓦氏菌免疫的差异表达蛋白质,从中获得25个差异表达蛋白质,其中上调表达的蛋白质有9个,下调表达的蛋白质有16个。利用实时定量PCR技术(q PCR)进一步验证了差异表达蛋白质在转录水平上的表达。在检测的10个蛋白质中只有蛋白酶体亚单位β-5型蛋白质的表达与蛋白质组检测水平一致。可能原因是差异蛋白质的表达存在不同水平的调控使得编码基因在转录水平和蛋白质水平表达量不一致。2、日本七鳃鳗L-STAT3的克隆、生物信息学及表达模式分析在所有差异表达蛋白质中,STAT3表达显著上调。将该基因进行了全长克隆,测序后发现该基因ORF区为2124 bp,编码708个氨基酸,根据氨基酸序列比对结果,该基因与其他物种来源的STAT3同源性较高,因此将该基因命名为L-STAT3。利用生物信息学预测并分析了L-STAT3编码氨基酸的结构特性和理化特征,并预测了该蛋白的结构。选取具有代表性的物种构建了STAT3的进化树,发现L-STAT3在进化上与七鳃鳗保持一致。3、日本七鳃鳗L-STAT3的原核表达、多克隆抗体制备及表达定位分析将L-STAT3的部分亲水性片段进行克隆并构建到p Cold I载体中,获得原核表达重组质粒。在E.coli Rosetta中表达并纯化了该蛋白。利用纯化蛋白制备得到anti-STAT3多克隆抗体,并验证了抗体的特异性。在转录水平上,希瓦氏菌刺激可使得L-STAT3在七鳃鳗心脏、肝脏、肠及肌肉中表达上调,而在白细胞及其他四种组织中表达下调。通过Western Blot技术对L-STAT3在日本七鳃鳗各组织的体内表达情况进行了检测。结果表明,经希瓦氏菌免疫刺激后,日本七鳃鳗L-STAT3蛋白在肾脏、鳃、肌肉、白细胞相对表达量较高。与对照组相比,希瓦氏菌刺激使得L-STAT3蛋白在白细胞、鳃、髓及肌肉中表达上调。免疫荧光显示L-STAT3蛋白主要定位于七鳃鳗髓样小体细胞的细胞质中,少量存在于细胞核。4、日本七鳃鳗L-STAT3的功能初探为了获得L-STAT3活性蛋白质,利用毕赤酵母表达系统构建并优化了L-STAT3的表达。将L-STAT3序列根据毕赤酵母基因表达特点进行稀有密码子优化后构建到毕赤酵母表达载体p PICZαA中,得到的重组质粒在毕赤酵母GS115中表达,在BMMY培养基中成功实现甲醇诱导分泌表达,在始终保持1%甲醇诱导终浓度的条件下,29oC 250rpm摇床培养120 h重组蛋白表达量达到最高。后期我们将对重组蛋白进行纯化和去内毒素处理,并探索不同浓度重组蛋白对细胞活性的影响。此外,构建了L-STAT3基因的真核表达载体,将去内毒素重组质粒瞬时转染到HEK-293T和Hela细胞,L-STAT3过表达提高了HEK-293T和Hela细胞的存活率。综上,本论文以希瓦氏菌诱导的七鳃鳗白细胞差异蛋白质组学为切入点,鉴定获得了应答希瓦氏菌免疫的差异表达蛋白质,为后续研究七鳃鳗适应性免疫系统发育的机制奠定了理论基础;对L-STAT3基因进行了功能初探,分析了该基因对于促进HEK-293T和Hela细胞增殖的作用,该结果为进一步探究七鳃鳗细胞增殖的作用过程提供了研究基础。