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目的：(1)分析从临床诊断为手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的患儿咽拭子标本中分离的脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗株(oral poliomyelitis vaccine,OPV)的基因型别以及VP1基因的变异,探讨OPV分离株准种在体内外的遗传进化方向。(2)从分子水平分析猪鼻支原体GDL-1(Mycoplasma hyorhinis GDL-1,Mh GDL-1)对用限制性片段长度多态性(Restricted fragment length polymorphisms,RFLP)方法鉴定脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)型别的干扰。 方法：本研究由四部分内容组成:(1)HFMD患儿咽拭子标本中的病毒分离与鉴定:首先将采自临床诊断为HFMD的患儿的133份咽拭子标本分别接种RD细胞和HEp-2细胞进行病毒培养;阳性的培养物经反复冻融后进行低速离心、取上清超滤浓缩后,提取病毒RNA。用肠道病毒71型(enterovirus type71,EV71)特异性引物和柯萨奇病毒 A组16型(Coxsakie A16,CA16)特异性引物进行 Real-time RT-PCR检测;对非EV71非CA16的标本使用肠道病毒通用引物经RT-PCR扩增病毒的VP4基因片断鉴定。(2)采用PCR-RFLP法对肠道病毒通用引物RT-PCR扩增VP4基因鉴定的两株 Sabin-1分离株进行具体的型别鉴定,随后分别对两株Sabin-1分离株以及糖丸疫苗中Sabin-1 VP1全长基因进行扩增和测序。(3)RFLP法鉴定OPV型别过程中,对未被核酸限制性内切酶切开的基因片段纯化回收后,连接T载体并挑取单克隆进行测序。(4)通过测序序列与GenBank中Sabin-1标准序列的比较,初步确定体内外sabin-1分离株准种的进化方向,然后通过分析RFLP法鉴定PV型别过程中未被限制性内切酶酶切片段测序序列,找到PCR产物未被限制性内切酶酶切的原因。 结果：(1)采用RFLP法对两株Sabin-1鉴定过程中,PCR扩增的基因片段在限制性内切酶酶切后电泳结果均呈现非典型的模式,其中FY11039 Sabin-1分离株的HpaⅡ单酶切电泳结果存在未被酶切的条带,而FY12110 Sabin-1分离株HaeⅢ、DdeⅠ、HpaⅡ单酶切电泳结果中均未被酶切的条带。(2)分别纯化回收未被酶切的电泳条带后,经T载体克隆测序,发现FY11039分离株VP1基因序列上第126位碱基由G突变成A,而导致VP1基因480bp片段无法被酶切。而FY12110分离株HaeⅢ、DdeⅠ、HpaⅡ的单酶切失败的条带,测序结果为猪鼻支原体GDL-1(P3蛋白)基因序列。(4)随机挑取的19个不同的FY11039分离株VP1基因全长克隆序列分析结果显示,出现VP1基因第126位碱基由G→A的共有7个不完全相同的克隆序列,其中序列突变率最大为0.44％。而随机挑取的23个不同的糖丸疫苗Sabin1 VP1基因全长序列克隆测序序列中,VP1基因第268位碱基由A→C的有7个不完全相同的克隆序列;VP1基因第270位碱基由A→G的有11个不完全相同的克隆序列;VP1基因第279位碱基由T→A或T→C,有4个不完全相同的克隆序列;VP1基因第316位碱基由A→G,有2个不完全相同的克隆序列。其中序列突变率最大为0.33%。 结论：(1) FY11039分离株部分准种序列的VP1基因480bp片段的HpaⅡ酶切位点的突变导致无法被酶切,提示经典的PCR-RFLP法不再满足所有脊髓灰质炎病毒(PV)型别鉴定,可能需要进?步结合VP1基因测序来完成对PV型别以及野毒株鉴定。 (2)FY12110分离株的RFLP法的酶切电泳图和测序结果说明,PV样本或病毒分离所用的细胞如果存在猪鼻支原体GDL-1污染,会对经典的PCR-RFLP法鉴定PV型别以及野毒株产生干扰。 (3)FY11039分离株、糖丸Sabin-1 VP1基因全长的多个单克隆序列分析发现: 1)FY11039分离株和糖丸Sabin-1 VP1基因相比较,突变的热点并不?致。FY11039 VP1基因突变集中在第126位,属于新发现的?个突变热点,但这并不引起氨基酸的改变。其次是FY11039 VP1基因并没有与柯萨奇A组病毒或者EV71有基因重组,因此没有证据证明Sabin-1疫苗突变株导致HFMD。 据此我们推断: 1、临床上有时将接种糖丸引起的疫苗反应误诊为手足口病。 2、采集样本时期可能会错过HFMD病原体存活最佳时期,咽拭子中混有脊髓灰质炎病毒疫苗株对实验造成干扰。 3、建议临床采集HFMD样本尽量取疱疹液,以便排除其他肠道病毒对实验诊断的干扰。