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乳酸(lactic acid)是一种重要的有机酸,特别是近年来,由于可生物降解的聚乳酸可以解决化学塑料带来"白色"污染,因而乳酸的生产和聚乳酸的合成已成为全世界研究的热点.乳酸分为D-乳酸、L-乳酸和D,L-乳酸.它们分别由代谢途径中的丙酮酸经过依赖于NADH的D-乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase,D-LDH)和L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)催化形成.因此探讨两种酶及其基因的结构与功能具有十分重要的意义.从青贮饲料中筛选出一株高产D,L-乳酸的细菌MD-1.该菌能在48℃、高糖条件下发酵生产乳酸;酵母粉、麸皮对乳酸发酵影响显著;生物素、对氨基苯甲酸和硫胺素对菌体生长及产酸有促进作用.在适宜条件下,菌株MD-1利用150g/L葡萄糖72h产生约140g/L乳酸.通过对乳酸菌MD-1进行表型和遗传等特征分析,确定MD-1属于乳杆菌属(Lactobacillus sp.),但发现该菌在碳源利用、16S rDNA、DNA同源性均和已报道的乳杆菌存在明显差异,推测可能是乳杆菌属的一个新种.以菌株MD-1为出发菌株,用乳酸脱氢酶基因(lactate dehydrogenase gene,简称ldh)和丙酮酸裂解酶基因(pyruvate formate-lyase gene,简称pfl)缺陷的Escherichia coliFMJ144作为宿主,在厌氧条件下,从构建的基因组DNA的随机表达基因文库,通过互补筛选获得菌株MD-1的D-乳酸脱氢酶基因(ldhD)和L-乳酸脱氢酶基因(ldhL),将其在E.coli中进行了表达,并对ldhD和ldhL的结构与功能的关系进行了探讨.ldhD编码331个氨基酸残基组成的蛋白质,具有典型的依赖于NADH的乳酸脱氢酶(ldh)特征.分析表明该基因核苷酸和编码的氨基酸序列,与其他菌株的ldhD相似性极低,相同性和相似性最高分别仅为39﹪和41.03﹪.因此,该ldhD是一个新的D-乳酸脱氢酶基因(D-LDH).通过在E.coli BL21(DE3)中表达该酶,其大小和预测的结果一致,具有D-LDH活性,其比活性达到1.84 U/mg,是对照的50倍.ldhL编码316个氨基酸残基组成的蛋白质,也具有典型的依赖于NADH的LDH特征.该ldhL和其他乳杆菌属的ldhL基因核苷酸序列和编码的氨基酸序列相似性较低,分别仅为64.1﹪和68.9﹪,是一个新的ldhL.在E.coli中表达了预测的ORF编码的蛋白质,并表现出L-LDH活性,其比活力约为对照菌株的40倍.通过对L-LDH和D-LDH进行比对,发现ldhL和ldhD没有明显的相似性,其进化距离很远,属于完全不同的脱氢酶家族.通过嵌合PCR分别构建了失活的ldhL和ldhD.采用基因敲除方法分别获得了ldhD失活的菌株IMD3082和ldhL失活的菌株IML3082,它们分别发酵产生L-乳酸和D-乳酸,其光学纯度可以达到97﹪以上,可用于L-乳酸或D-乳酸的生产.