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氧四环素(Oxytetracycline(OTC),通常称土霉素)及其它四环素类抗生素的杀菌机制主要是抑制细菌蛋白质的合成,对革兰氏阳性菌和阴性菌的生长均能产生明显的抑制作用,被认为是一种广谱性抗生素。随着时代发展,土霉素及其它早期开发使用的四环素类药物逐渐表现出一定的副作用及细菌耐药性,导致该类药物在临床上的使用量开始大幅度减少。但由于该类药物具有生产成本低,价格低廉等优势,土霉素在水产养殖业和畜牧业仍然具有广泛的应用,年需求量超出100,000吨;同时一些半合成的四环素类衍生物(二代及三代四环素)等开始被广泛应用于人类疾病的治疗和解决目前出现的细菌耐药性问题,这些新型四环素类药物主要是对早期“老四环素”分子进行一定化学修饰和改造,例如目前临床上正在使用的强力霉素就是以土霉素分子作为出发前体,将土霉素分子进行化学修饰得到甲烯土霉素,在甲烯土霉素的基础上做进一步化学改造得到抑菌效果好,毒性低的强力霉素。因此土霉素仍然具有广泛的市场应用价值。氧四环素是由辉瑞制药公司于1950年在龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)菌株发现并命名为土霉素(Terramycin,后改为Oxytetracycline),目前市场上使用的土霉素仍由该菌种由发酵合成。土霉素是一种具有重要研究价值的芳香聚酮类化合物,但关于龟裂链霉菌土霉素合成的途径特异性调控方面的研究鲜有报道,而工业生产中通过遗传改造龟裂链霉菌调控基因来提高土霉素的实例也很少。因此,本文对龟裂链霉菌土霉素合成全基因簇进行序列和功能分析,发现在土霉素生物合成基因簇内otrB基因相邻的位置存在一个抗生素调控蛋白家族(Streptomyces Antibiotic Regulatory Protein(SARP))的调控因子,经蛋白序列比对发现该调节因子与其它链霉菌途径特异性调控蛋白的具有较高的相似性,推测该基因能够调控土霉素的合成,并将其命名为otcR(Oxytetracycline Regulator)。同源重组技术敲除otcR基因导致龟裂链霉菌M4018(早期辉瑞制药用于生产土霉素的菌株)土霉素合成终止,同时对otcR基因进行回补遗传操作,土霉素又能重新合成,这表明otcR是龟裂链霉菌土霉素生物合成的一个非常关键的激活因子。荧光定量PCR实验进一步表明在龟裂链霉菌宿主内过表达otcR基因(增加otcR基因拷贝数)导致土霉素合成基因簇内5个结构基因(oxyA,oxyI,oxyJ,oxyR和oxyS)的转录水平明显提高。SARP类家族调控蛋白的作用原理主要是结合目的基因的启动子区调控目的基因的转录表达,为了进一步研究OtcR蛋白对土霉素合成基因簇的详细调控机制,本文利用生物信息学分析方法对土霉素合成基因簇内的5个结构基因(oxyA,oxyI,oxyJ,oxyR和oxyS)的启动子序列分别进行了保守性分析和预测,发现这5个基因的启动子序列区域均具有2或3个相似性很高的正向串联重复DNA序列,这些保守的DNA序列按相似度可划分为包括9个脱氧核糖核苷酸或6个脱氧核糖核苷酸的重复结构单位,每个串联重复结构的DNA序列之间都相隔11个脱氧核糖核苷酸,这种重复序列的串联排列方式以及两个相邻重复结构之间间隔9个脱氧核糖核苷酸的特征比较符合典型的SARP类家族蛋白的识别和结合位点,SARP类家族蛋白通常以二聚体形式结合在启动子序列的两个串联重复结构序列上对靶基因的转录进行调控,为了进一步研究OtcR对oxyA,oxyI,oxyJ,oxyR和oxyS启动子的结合和转录调控作用,本文采用绿色荧光蛋白(Green Fluorescein Protein,GFP)报告系统来表征OtcR对上述含有串联重复DNA结构的启动子转录表达的影响,实验结果表明,在大肠杆菌异源宿主背景下,以不含otcR基因载体的菌株作对照,含有otc R调控因子载体的菌株均能明显增强oxyA,oxyI,oxyJ,oxyR和oxyS启动子的转录表达,绿色荧光水平值提高约1.3至4倍,表明OtcR蛋白确实能显著促进土霉素合成结构基因的转录表达;同时选择oxyI基因启动子(Poxy I)做进一步的测试,人为设计并对该基因启动子区域内串联重复结构DNA序列中的某些脱氧核糖核苷酸进行替换(突变后的启动子为PoxyI1*和PoxyI2*),通过碱基替换降低两个串联排列DNA序列的相似性或重复性,通过绿色荧光值进行表征,发现突变后的启动子转录表达活性明显降低,因此进一步说明OtcR通过结合启动子区域内的正向串联重复结构区域来调控土霉素合成基因簇的转录表达。遗传操作链霉菌调控基因的转录表达水平是提高链霉菌合成抗生素产量的一个非常有效的策略,通常通过组成型强启动子简单的过表达途径特异性激活子就能够显著促进抗生素的合成,利用这种工程改造策略成功提高抗生素产量的案例很多。因此,本文将OtcR作为工程操作的靶点,采用强启动子过表达otcR或通过基因重组的方式增加龟裂链霉菌基因组内otcR基因的拷贝数等手段,来增强otcR基因的转录表达强度,发酵结果表明过表达otcR突变株土霉素产量明显高于出发菌株M4018,土霉素产量提高4~6倍;为了进一步提高龟裂链霉菌M4018合成土霉素产量,在过表达otcR基因的基础上,本文进一步增强乙酰辅酶A羧化酶表达量来提高M4018菌株胞内土霉素合成的前体物(或起始底物)丙二酸单酰辅酶A含量,随着胞内丙二酸单酰辅酶A浓度提升,土霉素产量提高1倍。因此,在上述两种策略基础上,对出发菌株M4018进行综合的工程改造,同时过表达途径特异性调控蛋白OtcR和增强乙酰辅酶A羧化酶表达,发酵检测改造后的重组工程菌株土霉素的产量由出发株的1.37g/L提高到9.09g/L,同时还发现该重组工程菌株对培养基中碳源和氮源的利用率也明显增加,但菌体生物量没有发生显著改变,这表明重组工程菌株将更多的营养物质合成转化为土霉素。该部分工作所尝试的研究策略对于工程改造龟裂链霉菌提高土霉素的产量具有一定的指导意义。目前大多数制药企业仍然采用龟裂链霉菌作为发酵培养对象来合成土霉素,但该菌株发酵生产周期一般较长,大约需要8~10天,整个发酵流程才能结束,耗费大量人力,时间及水电能源,同时工业生产的菌株本身一般具有较高的抗生素耐受性等复杂的遗传背景,如龟裂链霉菌M4018能够耐受非常高浓度的安普霉素和卡那霉素,但这些抗生素是分子遗传操作的常用的筛选标签,因此对这样的工业菌株进行后续的分子遗传操作存在很大的困难。为了解决上述问题,本文对龟裂链霉菌土霉素合成基因簇进行了异源宿主的表达操作,将土霉素合成基因簇重组到其它生产速度快、分子遗传实验操作比较容易的链霉菌宿主中,实现土霉素异源宿主的合成。通过对几株常用链霉菌宿主的比较发现,委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)WVR2006具有生长速度快,分子遗传操作成熟,菌体分散性良好等特点,通过耐受性实验发现WVR2006对土霉素的自然耐受性也很高,非常适合作为土霉素合成基因簇的异源表达的宿主,同时委内瑞拉链霉菌也是业界人士公认的作为异源表达抗生素合成基因簇的理想宿主。通过在委内瑞拉链霉菌宿主内对土霉素合成基因簇、调控基因以及合成起始底物供应等方面的遗传操作,如过表达途径特异性调控蛋白OtcR、敲除土霉素外排的抑制蛋白OtrR以及增加乙酰辅酶A羧化酶表达量等,逐步使委内瑞拉链霉菌宿主合成土霉素的产量由75mg/L提升到431mg/L,这个产量相当于龟裂链霉菌M4018在与委内瑞拉链霉菌相同培养条件的发酵产量结果,而发酵周期只需要48小时。本部分工作表明委内瑞拉链霉菌WVR2006可适用于表达土霉素合成基因簇,能够缩短土霉素的发酵周期。当今社会正处于合成生物学技术快速发展的阶段,通过对微生物有目的的进行分子遗传操作和改造来影响微生物的生理代谢途径,从而使之合成目标化合物的产量大幅度提高,或使之合成更有价值的新的活性产物。近年来利用这种菌种改造策略成功的案例也越来越多。本论文按照上述设计理念,主要对土霉素产生菌做了相应的代谢工程操作和尝试,使土霉素的产量和发酵培养周期等方面得到了优化。