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肿瘤的代谢重编程是维持肿瘤细胞增殖存活的关键。从20世纪Warburg效应提出以来,人们对肿瘤代谢的认识不断加深,代谢重编程被认为是正常细胞转化为恶性肿瘤的显著性标志。在肿瘤细胞中代谢重编程主要表现为有氧糖酵解的增强和谷氨酰胺代谢的活跃等。神经胶质瘤(Glioma)是一种最常见的颅内肿瘤,因其高复发率、高死亡率的特点,一直以来被看作是临床治疗上的难题。课题组前期表达纯化得到的东亚钳蝎氯离子通道毒素蛋白(Buthus martensii Karshch chlorion channel toxin,BmKCT),已被证实能够抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭,但是分子机制尚不清楚。本研究主要是通过代谢组学的方法探究BmKCT抑制胶质瘤细胞增殖的分子机制。首先,通过蛋白表达纯化得到融合蛋白GST-BmKCT,利用圆二色谱检测蛋白质的二级结构和热稳定性。利用MTT法检测GST-BmK CT的增殖抑制活性。利用气质联用仪(GC-MS)分析鉴定出胶质瘤细胞内63种代谢产物,并且发现与GST处理组相比,BnKCT处理胶质瘤细胞48小时胞内丙酮酸水平降低,谷氨酸和谷氨酰胺在胞内聚集。丙酮酸是由丙酮酸激酶(Pyruvate kinase isozymes M2,PKM2)催化形成的,低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作为PKM2的转录因子存在。我们的结果显示GST-BmK CT降低HIF-1α和PKM2的表达。进一步实验数据显示BnK CT能够降低葡萄糖消耗,乳酸分泌和胞内ATP水平。说明BmK CT能通过下调HIF-1α的表达,抑制PKM2介导的有氧糖酵解,使胞内的ATP水平降低。但是我们发现根据葡萄糖消耗水平计算,单纯的有氧糖酵解并不会使胞内ATP水平下降87.66%。谷氨酰胺消耗是肿瘤细胞产生ATP的另一条主要代谢途径。我们的数据结果表明BmKCT可以与基质金属蛋白酶2(Matrix matalloproteinases 2,MMP-2)、整合素αvβ3在胶质瘤细胞膜表面结合,抑制PI3K/AKT信号通路,引起下游联级反应,包括过表达沉默信息调节子4(Silent information regulator 4,SIRT4)和下调HIF-1α,使谷氨酸脱氢酶1(Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)催化活性和转录水平均降低,从而使谷氨酸向α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate,α-KG)转化受阻,ATP水平降低。此外,BmKCT能够降低谷氨酸向胞外的转运,进而降低胱氨酸的摄入。同时我们发现BmK CT 下调γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-Glutamyl systeine synthetase,γ-GCS)在转录水平的表达,γ-GCS是谷胱甘肽合成途径的限速酶。胱氨酸摄入的降低和限速酶表达的下调使胞内谷胱甘肽合成受阻,ROS水平升高,释放细胞色素C(Cytochrome C,cytC)并且通过上调caspase-9/caspase-3表达促进胶质瘤细胞凋亡。主要结果如下:1.基于实验室前期的实验技术表达纯化得到融合蛋白GST-BmK CT。圆二色谱检测结果显示GST-BmK CT在pH 6.5和pH 7.4条件下均具有蛋白质二级结构,并且热稳定性良好。通过MTT法证实GST-BmK CT抑制胶质瘤细胞增殖,并且随浓度和时间呈正相关。2.利用GC-MS检测胶质瘤细胞内小分子代谢产物,MetaboAnalyst分析显示在胶质瘤细胞内谷氨酸代谢呈现高度活化的状态。通过主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA)发现,与GST处理组相比,GST-BmKCT处理胶质瘤胞48h胞内的谷氨酸和谷氨酰胺聚集,丙酮酸含量下降。同时,高效液相色谱(HPLC)结果显示,GST-BmK CT使胞外谷氨酸含量降低。3.GST-BmK CT抑制胶质瘤细胞乳酸分泌,葡萄糖消耗和胞内ATP含量。通过qPCR和Western blot检测了 PKM2、HIF-1α表达情况。结果显示GST-BmK CT通过下调HIF-1α抑制PKM2的表达,从而抑制胶质瘤细胞有氧糖酵解。4.通过Pull down分析和免疫荧光结果表明GST-BmK CT能与MMP-2直接相互作用,并且与整合素αvβ3和MMP-2复合物在胶质瘤细胞表面结合。利用Western blot检测了 PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平,结果显示BmK CT抑制PI3K且可选择性地抑制AKT磷酸化。5.利用qPCR和酶活检测发现,与GST组相比,GST-BmK CT组能降低GLUD1转录水平和催化活性。之前有研究证实GLUD1的转录水平与HIF-1α呈正相关,GLUD1活性与SIRT4呈负相关。我们分别通过Western blot和qPCR进行验证。6.qPCR分析表明GST-BmK CT下调胶质瘤细胞γ-GCS转录水平,使胞内的ROS水平升高,促进胶质瘤细胞凋亡。当同时加入BmKCT和NAC(一种ROS清除剂),这种促凋亡现象消失。利用Western blot检测凋亡相关蛋白cytC/caspase-9/caspase-3,结果提示GST-BmK CT促进cytC的释放并上调caspase-9/caspase-3蛋白的表达来诱导细胞凋亡。