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作为关键的手性中间体，(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)因其在选择性合成手性药物方面的广泛应用而受到愈来愈多的关注。不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制备(S)-CHBE的酶合成法所具备的经济和社会效益等方面的优势使其成为了当今的研究热点。醇脱氢酶能实现上述反应的高效进行，然而同时需要消耗一定量的辅酶NAD(P)H。由于该类还原型辅酶的价格较高且稳定性较低，一定程度上限制了生产中大量投加辅酶，从而辅酶再生体系应运而生。其中，甲酸/甲酸脱氢酶构建的辅酶再生体系具备成本低廉、反应接近不可逆、产物易分离、无污染等优势，成为辅酶再生体系的首选。然而，该体系仅能实现辅酶NADH的再生。因此，对于NADPH依赖型的醇脱氢酶而言，研究其辅酶特异性结构性原理以获得辅酶特异性改变的突变酶，进一步应用到甲酸/甲酸脱氢酶辅酶再生体系，对于开拓(S)-CHBE的工业应用价值有着极其深远的研究意义。 本研究以来自木兰假丝酵母Candida magnolia的NADPH依赖型的醇脱氢酶3(ADH3)为研究对象，基于计算机辅助设计及定点突变技术，理性改造了醇脱氢酶的辅酶特异性;另一方面，通过突变酶和甲酸脱氢酶的高效共表达，获得了具有较高催化效率的重组菌株。 基于Listeria monocytogenes酰基载体蛋白还原酶(PDB code:4JRO)的蛋白晶体X-射线衍射结构，同源模拟构建ADH3的空间结构模型。通过分子对接分别构建ADH3-NADPH以及ADH3-NADH复合物模型，比对与分析不同的空间结构及基团之间不同的作用力，选择ADH3辅酶结合域中Ser13，Ala34，Ser35，Arg36为关键氨基酸位点。结合Swiss-PDB软件对筛选获得的位点实施虚拟突变，理性分析突变对酶的辅酶特异性、催化活性的影响。 采用定点突变技术，构建相应的突变株Escherichia coli BL21/pET-S35D，BL21/pET-S35D/R36I, BL21/pET-A34I/S35D/R36I, BL21/pET-S13A/S35D/R36I,BL21/pET-S13A/A34I/S35D/R36I。分别层析纯化ADH3及5种突变酶，并研究了突变酶S13A/A34I/S35D/R36I的酶学性质。酶活测定结果表明突变酶的辅酶依赖型均发生显著变化，其中除单位点突变酶外，辅酶特异性均发生了彻底的改变;多位点突变酶A34I/S35D/R36I、S13A/S35D/R36I和S13A/A34I/S35D/R36I的酶活均有一定程度的提高，其中突变酶S13A/A34I/S35D/R36I的酶活是突变前的3倍。动力学参数研究结果表明，突变前的ADH3对辅酶NADPH显示出较大的亲和力，单位点突变酶S35D的辅酶特异性虽未彻底改变，但(kcat/Km)NADH/(kcat/Km)NADPH比值为1.5，表明S35D的辅酶依赖型已由绝对的NADPH依赖型变为更倾向于依赖辅酶NADH。突变酶S13A/A34I/S35D/R36I测得最小的Km值0.2mM，且kcat/KmCOBE为330mM-1S-1，是依赖于NADPH的野生型ADH3的16.5倍。 利用基因工程手段构建了突变酶S13A/A34I/S35D/R36I与甲酸脱氢酶FDH的共表达菌株，有效地解决了辅酶再生体系中两个酶反应速率的平衡问题，分析并优化了其生物催化功能，实现了辅酶的高效原位再生。对催化体系中底物与辅底物的比例进行优化，当甲酸钠与COBE的比率为2时，两相体系中反应6h，30g/L底物的转化率最高可达100％。