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目的探究关东丁香叶总黄酮和总环烯醚萜的不同提取工艺,比较不同提取工艺的优缺点并选择最佳提取工艺。测定关东丁香叶中总黄酮和总环烯醚萜含量,探究关东丁香叶中化合物的高效液相色谱分析方法。探究关东丁香叶提取物对脂多糖所致的ICR小鼠急性肝损伤的保护作用,确定有效部位,为关东丁香叶的开发提供理论依据。方法利用两相溶剂萃取法分离化合物,使用乙醇冷浸、回流,石油醚脱脂,由乙酸乙酯萃取得到总黄酮提取物,正丁醇萃取得到总环烯醚萜提取物。采用响应面法考察各提取因素,对比不同提取因素对总黄酮和总环烯醚萜提取物含量的影响。在单因素考察的基础上探究温度、提取时间、溶剂使用量、溶剂浓度的最佳组合。采用紫外分光光度法测定乙酸乙酯部位中总黄酮含量和正丁醇部位中总环烯醚萜含量。建立高效液相色谱法同时测定关东丁香叶中酪醇、橄榄苦苷、紫云英苷、芦丁、异槲皮苷、原儿茶酸的含量并比较不同采收时期六种物质含量差异,确定最佳采收时期。建立脂多糖诱导的ICR小鼠急性肝损伤模型,使用关东丁香叶提取物进行抗炎实验,采用ELISA法检测急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、SOD活性,MDA、TNF-α和ICAM-1含量,采用苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化染色,光学显微镜下观察各组小鼠肝脏病理学形态的改变情况。采用免疫印迹技术检测各组小鼠肝脏炎性物质的蛋白表达情况。结果建立了紫外分光光度法(UV)测定乙酸乙酯萃取部位中总黄酮含量和正丁醇萃取部位中总环烯醚萜含量的方法,二者在提取部位中的含量均超过50%,确定乙酸乙酯和正丁醇为提取的有效部位。2、响应面设计具有连续性,通过响应面模型对数据进行拟合可以分析出精准的提取方案,在最佳方案提取下提取率更高,但本实验考察因素及区间有待进一步扩大。3、通过响应面法得总黄酮和总环烯醚萜质量和为9.754 g,在此条件下100 g关东丁香叶得总黄酮浸膏质量为4.741 g、提取率为2.784%、提取物经测定总黄酮含量达58.72%;总环烯醚萜浸膏质量为5.013 g、提取率为3.166%、总环烯醚萜含量达63.16%。4、建立了同时测定关东丁香叶中酪醇、橄榄苦苷、紫云英苷、芦丁、异槲皮苷、原儿茶酸含量的色谱分析方法。6种成分在30 min内完全分离。回归方程和线性范围依次为:芦丁Y=121447X-64136,13.8-137.6μg/m L;酪醇Y=116207X-24092,12.8-128.0μg/m L;原儿茶酸Y=46915X+39201,9.9-99.2μg/m L;橄榄苦苷Y=145157X-119072,11.8-118.4μg/m L;紫云英苷Y=97109X-23591,10.6-105.6μg/m L;异槲皮苷Y=236284X-9372.4,13.4-134.4μg/m L。平均加标回收率依次为99.04%(RSD=1.09%),99.17%(RSD=1.12%),98.83%(RSD=0.74%),98.83%(RSD=0.64%),99.00%(RSD=0.75%),99.21%(RSD=0.92%)。5、关东丁香叶总黄酮和总环烯醚萜提取物的高、低浓度均能降低由脂多糖(LPS)诱导的小鼠血清中ALT和AST活性升高情况,降低MDA含量,提高小鼠肝脏中SOD的活性,影响程度与剂量成正相关趋势。其中总环烯醚萜提取物作用效果>甘利欣>总黄酮提取物>水提物。6、关东丁香叶中总黄酮和总环烯醚萜提取物均能降低由于炎症引发的肝脏肥大、质量增加现象,肝脏指数较LPS组实验小鼠明显降低,影响程度与剂量成正相关趋势。其中总环烯醚萜提取物作用效果>甘利欣>总黄酮提取物>水提物。7、染色结果:HE染色光镜图片显示注射总黄酮提取物和总环烯醚萜提取物实验组小鼠,肝细胞结构损伤、炎性溢出、细胞膜破坏等情况减少,与LPS实验组比较损伤情况得到明显改善,与空白对照组比较无明显差异。水提物组作用效果不明显。结果说明:关东丁香叶的总黄酮和总环烯醚萜提取物可减轻LPS诱导的小鼠肝脏病理学损伤程度。免疫组化染色图片结果显示,甘利欣、总黄酮和总环烯醚萜提取物组细胞染色较浅,与LPS组对比明显,水提物组染色情况与LPS组对比无明显变化。结果说明:关东丁香叶总黄酮和总环烯醚萜提取物可减轻小鼠肝细胞病理损伤,对急性肝损伤具有保护作用。8、免疫印迹结果:总黄酮、总环烯醚萜提取物,甘利欣能够抑制LPS诱导的TNF-α及ICAM-1的蛋白表达情况,降低TNF-α及ICAM-1的蛋白含量。水提物组能够抑制LPS诱导的TNF-α及ICAM-1的蛋白表达情况,但效果不明显。9、关东丁香叶提取物能够改善急性肝损伤小鼠的外部体征和精神状态,使其活动增多,进食增多,提高小鼠存活率。其作用效果依次为总环烯醚萜>总黄酮>水提物。结论紫外分光光度法操作简单,易于掌握,结果可靠,可用于关东丁香叶中总黄酮和总环烯醚萜的含量测定。HPLC法可同时测定关东丁香叶中芦丁、酪醇、原儿茶酸、紫云英苷、异槲皮苷、橄榄苦苷的含量,方法灵敏度高,线性好,回收率高,结果准确。确定了关东丁香叶总黄酮和总环烯醚萜提取物为抗炎的有效部位,提取物均具有显著地抗炎效果,降低炎性因子的表达,抑制肝细胞炎性病变,能够治疗小鼠急性肝损伤疾病,对肝脏具有保护作用。