重组ProEMAPⅡ/P43大肠杆菌(BL21(DE3))的发酵,纯化及活性研究

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在构建的rProEMAP/P43工程菌的基础上,对工程菌发酵过程中诱导物及其浓度、诱导时间等重要参数进行了考察:结果为IPTG浓度1mmol/L,诱导时间控制在4~5h,发酵过程中温度控制在30℃,pH控制在7.2左右。 通过5L、50L、500L反应器逐级放大,菌体生长均可以达到OD600为40以上,并且rProEMAP/P43可溶性表达约为总蛋白的20%。 利用发酵过程生产的菌体,对菌体的破碎方法进行了比较,高压破碎法破碎效果比超声好,适合工艺放大。同时,建立了一套rProEMAP/P43的纯化工艺,得到纯度在90%以上的样品,将样品用于体外脐带内皮细胞生长抑制作用的活性检测实验,半增殖抑制浓度(EC50)为1.1×10-1μg/ml,取得了预期的效果。 在rProEMAP/P43纯化工艺优化的基础上,实现了小规模生产。600g湿菌体得到2.522g纯度在95%的样品。将其用于体内药效学预实验,在三种动物瘤模型中,肿瘤抑制率均高于40%,在四种人癌裸小鼠移植瘤模型,相对肿瘤增殖率均低于60%,符合评价指标,满足SDA申报要求。
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