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研究目的证实前列腺素E1(PGE1)治疗糖尿病肾病的新机制—减少肾小管上皮细胞的凋亡,并进一步研究其作用机制。研究方法第一部分:利用单侧肾切除+链脲菌霉素(STZ)的方法建立大鼠糖尿病肾病(DKD)模型。实验分4组:假手术组(Sham组)、单侧肾切除组(Unx组)、Unx+STZ组(DKD组),Unx+STZ+前列腺素E1干预组(PGE1组)。实验共48天,分别于手术前、糖尿病(DM)成模后的4周、PGE1干预10天后收集各组大鼠尿液,测定24h尿微量白蛋白。另外,肾组织行苏木素-伊红染色(HE)、糖原染色(PAS)、六胺银染色(PASM),以确定DKD是否成模。PGE1尾静脉注射10天后,处死动物,PAS观察肾脏病理;TUNEL和免疫荧光分别检测肾小管上皮细胞的凋亡和凋亡蛋白Bim的表达;免疫组织化学染色检测肾皮质Bim Bax和Bcl-2的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白Bim、Bax和cleaved caspase-3的表达。第二部分:利用肾小管细胞系(HK-2细胞),用CCK-8法筛选PGE1的最佳浓度和最佳干预时间。HK-2细胞分为3组:甘露醇低糖组(MG组)、高糖组(HG组)和PGE1组。刺激48h后,流式细胞术和TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡;免疫荧光检测凋亡蛋白Bim的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白Bim、Bax、cleaved caspase-3以及p-JNK、JNK的表达。检测高糖不同时间点(1h、6h、12h、24h、48h)的p-JNK、JNK、Bim蛋白表达情况。应用JNK激动剂茴香霉素(Anioomycin,AM)和JNK抑制剂SP600125后,分别检测p-JNK、JNK、Bim蛋白表达情况。HK-2细胞分为5组:MG组、HG组、HG+PGE1组、HG+AM组、HG+PGE1+AM组,刺激48h后,检测p-JNK、JNK、Bim蛋白表达情况。统计学分析:所有计量资料以均数±标准误表示,采用SPSS 21.0统计软件进行统计,两组之间数据的比较采用t检验,多个组间数据的比较采用单因素方差分析,认为有统计学意义的P界值为0.05。研究结果第一部分:1.单侧肾切除+STZ 3天后,大鼠出现典型糖尿病症状,即多饮、多食、多尿,且血糖>16.7mmol/L,即DM模型成立。尿量超过自身原始尿量的1.5倍,24h微量白蛋白水平超过同期正常大鼠的10倍或以上,同时在DM成模4周后行HE、PAS以及PASM观察:肾小球基底膜和系膜增厚,基质增多,肾小管上皮细胞出现扩张、脱落、绒毛缺失,证实DKD模型成立。2.给予PGE1后取肾脏进行检测:①PAS:与对照组相比,DKD组的肾小球基底膜和系膜增厚,肾小管基底膜增厚,PGE1组肾小球基底膜和系膜以及肾小管基底膜增厚均明显改善。②TUNEL:Sham组和Unx组肾小管细胞凋亡数目相差不大,无统计学意义;DKD组较对照组(Sham组和Unx组)相比,肾小管上皮细胞凋亡数目增加;PGE1组较DKD组凋亡减少;对照组、DKD组、PGE1组之间差异有统计学意义(P<0.05)。③免疫荧光:Bim蛋白在DKD组表达最高,PGE1组Bim表达较DKD组表达减少。④免疫组化:Bim只在肾小管表达,Bcl-2和Bax在肾小球和肾小管均有表达。与对照组相比,Bim和Bax蛋白在DKD组表达增加,PGE1组Bim和Bax表达均比DKD组减少,Bcl-2表达与两者刚好相反。⑤Western Blot:DKD 组大鼠肾皮质匀浆 Bim、Bax 和 cleaved caspase-3表达增加(P<0.05 vs 对照组)。PGE1 组 Bim、Bax 和 cleaved caspase-3 表达减少(P<0.05 vs DKD 组)。第二部分:1..CCK8:PGE1最佳干预浓度和最佳干预时间分别是10uM和48h。2.流式细胞术:HG组的细胞凋亡增加(P<0.05 vs对照组)。PGE1组细胞凋亡减少(P<0.05 vs HG组)。3.TUNEL:HG组细胞凋亡数目增加(P<0.05 vs对照组),PGE1组细胞凋亡明显下降(P<0.05 vs HG组)。4.免疫荧光:HG组Bim表达最多,PGE1组较HG组比较明显下降。5.Western blot:①HK-2细胞分为MG组、HG组、PGE1组,培养48h后,HG组的p-JNK、Bim、Bax 和 cleaved caspase-3 的表达增高(P<0.01,0.05,0.05,0.01 vs MG 组),PGE1组四者蛋白表达降低(P<0.01,0.05,0.05,0.05 vs HG组)。②随着时间梯度的增加,在高糖的刺激下,HK-2细胞的p-JNK和Bim蛋白的表达梯度增加,两者变化趋势一致,在48小时表达最高,JNK的表达不变。③高糖中加入JNK激动剂AM后,HK-2细胞分为MG组、HG组、HG+AM组,HG 组 p-JNK 和 Bim 蛋白表达增加(P<0.05,0.05 vs MG 组),HG+AM 组 p-JNK和Bim蛋白表达进一步上调(P<0.01,0.05 vs HG组)。④高糖中加入JNK抑制剂SP600125后,HK-2细胞分为MG组、HG组、HG+SP600125 组,HG 组 p-JNK 和 Bim 蛋白表达增加(P<0.05,0.05 vs MG 组),HG+SP600125 组 p-JNK 和 Bim 蛋白表达下降(P<0.05,0.05 vs HG 组)。⑤HK-2 细胞分为 MG 组、HG 组、HG+PGE1 组、HG+AM 组、HG+PGE1+AM 组,HG组 p-JNK 和 Bim 蛋白表达增加(P<0.01,0.01 vs MG 组);HG+AM 组 p-JNK、Bim表达较 HG 组进一步增加(P<0.01,0.01 vs HG 组);HG+PGE1 组 p-JNK、Bim 表达较 HG 组降低(P<0.05,0.01);HG+PGE1 组 p-JNK 和 Bim 表达较 HG+PGE1+AM组增加(P<0.01,0.05);HG+AM+PGE1组与HG+AM组比较,p-JNK表达的差异无统计学意义(P>0.05),而Bim表达下降(<0.01)。研究结论1.体内和体外实验实验表明,高糖增加肾小管上皮细胞凋亡,并上调肾小管 Bim、Bax 和 cleaved caspase-3 蛋白的表达。2.体内和体外实验实验表明,PGE1能减少肾小管上皮细胞的凋亡,并下调肾小管Bim、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达。3.体外实验表明,p-JNK和Bim蛋白随高糖培养时间的延长而升高。高糖环境下给予JNK激动剂后,p-JNK和Bim蛋白表达进一步升高;给予JNK抑制剂后,两者蛋白同时下降,说明JNK可调控Bim。4.PGE1联用JNK激动剂后较单用PEG1比,p-JNK上升,但Bim表达稍上升,激动剂不能完全逆转PGE1导致的Bim下降;JNK激动剂联用PGE1后较单用JNK激动剂比,p-JNK几乎不变,而Bim表达明显下调,JNK在被持续激动的情况下,给予PGE1后,仍有Bim下降,提示PGE1部分通过JNK来减缓Bim表达,尚存在其他分子参与PGE1减缓的Bim表达,即PGE1不完全依赖JNK/Bim通路介导减缓的肾小管凋亡。