【摘 要】
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小麦是世界重要的粮食作物之一,小麦产量的丰歉在粮食供给方面占有重要地位,而小麦品种的抗病性是小麦产量的保障.白粉病是小麦的主要真菌病害之一,由于白粉菌生理小种众多且
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小麦是世界重要的粮食作物之一,小麦产量的丰歉在粮食供给方面占有重要地位,而小麦品种的抗病性是小麦产量的保障.白粉病是小麦的主要真菌病害之一,由于白粉菌生理小种众多且变异速度快,因此选育对白粉病具有广谱抗性的小麦品种非常必要.利用抗病基因工程提高小麦的抗病性和单位面积产量,是培育新的小麦抗病品种的一条有效途径.研究表明,大麦mlo基因隐性纯合突变体对白粉病具有广谱抗性,小麦是大麦的近缘种,二者的mlo基因cDNA有92﹪的同源性,它们有着相似的作用机制.因此,利用反义技术和PTGS技术减弱或关闭感病植株中内源Mlo基因的表达,有望提高小麦对白粉病的抗性.该工作首先对现有的植物双元表达载体pROK2进行改造,切除了选择标记基因NPTⅡ,并将35S启动子更换为在单子叶植物中表达效率较高的Ubiquitin启动子,这样就得到了不含选择标记基因的适合于单子叶植物转化的植物表达载体pRAL.将小麦mlo基因cDNA片段以3→5方向插入Ubiquitin启动子之后,构建成mlo基因的反义表达载体.另外,选择mlo基因cDNA上的合适区段(29nt),设计合成寡核苷酸片段,经延伸反应后能形成该区段的反向重复结构,且含有8nt的插入片段以便在转录后形成茎环结构,并在其两端加上合适的酶切位点,利用这些位点将此片段定向插入到pRAL的多克隆位点中,构建成mlo基因的shRNA表达载体.另外,为了更好地利用RNAi技术,研究植物基因组中大量未知功能的基因,特别是禾谷类植物功能基因组学的研究,我们还构建了通用的植物双链RNA抑制载体.分别用冻融法将小麦mlo基因的反义表达载体和shRNA表达载体转入农杆菌菌株AGL1中,以农杆菌介导的苗端转化法转化具推广潜力但对白粉病敏感的小麦品种,反义表达载体转化核生3号360株、烟2801 290株,共得到存活并结种的反义转化T<,0>代植株核生3号145株、烟2801 79株.在抽穗灌浆期对其进行白粉菌接种,植株对白粉病的抗性表现出明显的差异,其中60﹪左右的植株表现为对白粉病免疫或高抗.温室中生长的部分T1代植株仍表现出对白粉病免疫或高度抗性,同时出现了较多表型变异,可能是由于插入位点对基因表达的影响,其中也有对育种有利的性状如小穗增多等.shRNA表达载体转化小麦烟2801 250株、烟优361 60株、小麦与高冰草体细胞融合后代杂种11号150株,转基因植株正在生长中,对白粉病的抗性也己表现出明显差异.
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