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目的:肾脏衰老是老年慢性肾脏病的病理学基础,而肾间质纤维化是肾脏衰老的重要表现。肾间质纤维化,以细胞外基质沉积为特征,导致肾脏结构和功能的丧失。防治肾间质纤维化是保护老年肾功能、阻止CKD进展的重要手段。前期研究发现老年大鼠骨髓间充质干细胞外泌的微囊泡(MSC-MV)中miR-294表达下调,并且miR-294抑制转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞上皮间充质转分化(EMT)。本研究将进一步解析miR-294调控TGF-β1通路的靶基因,探讨m i R-294对老年肾间质纤维化的治疗作用。方法:(1)过表达HK-2中miR-294,并建立TGF-β1诱导HK-2上皮转分化模型,运用蛋白印记法(Western Blot)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光方法检测EMT相关指标,验证miR-294干预肾小管生皮细胞EMT的作用。利用生物信息学方法查找miR-294在TGF-β1通路的可能靶基因,并运用双荧光素酶实验进行验证。(2)建立老年小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾脏损伤模型,利用转染试剂尾静脉注射m i R-294,通过检测肾脏组织病理、肾间质纤维化标志物差异评估miR-294干预老年肾间质纤维化的疗效。结果:(1)体外实验:①TGF-β1 (10ng/ul)诱导HK-2细胞纤维化48小时后,miR-294mimic/NC-miR (20pm/ul)转染 HK-2 细胞 24 小时,可见 miR-294 + TGF-β1组细胞内miR-294明显过表达(增高248454倍)。②经TGF-β1诱导的HK-2细胞,失去上皮细胞形态,呈现为长梭形的成纤维细胞形态;转染NC-miR后,细胞形态较转染之前无明显改变;转染miR-294 mimic后,部分细胞可恢复正常形态。③Western Blot显示转染miR-294后间质细胞的标志物α -SMA、fibronectin、COL3A1表达量较TGF-β1组明显下调,上皮细胞标记物E-cadherin较TGF-β 1组有所增加;免疫荧光显示TGF-β1组EMT标志物α-SMA表达量较空白组明显上升,转染miR-294后纤维化α -SMA表达量明显下调。④利用生物信息学分析miR-294的可能靶基因为RBL1;双荧光素酶报告基因实验显示共转染miR-294mimic后,pGL3-WT-RBL1的荧光素酶活性明显下降(P<0. 05),但对pGL3-Mut-RBL1的荧光素酶活性影响不明显;共转染后对NC组pGL3-WT-RBL1的荧光素酶活性无影响;Western Blot显示TGF-β1诱导EMT后细胞内RBL1表达明显增高。(2)体内试验:①成功构建UUO老年小鼠肾损伤模型。②RT-PCR显示与sham组及同一时间点的UUO组相比较,注入miR-294过表达转染复合物后7天、14天小鼠肾组织miR-294的表达量明显增高。③与同一时间点的UUO组比较,m i R-294组靶基因RBL1的蛋白表达量明显下调;α-SMA、fibronectin的表达量明显下降;肾脏组织胶原沉积明显减少。④治疗后14天,m i R-294组血清肌酐水平明显低于UUO 组。结论:(1) RBL1是miR-294调控TGF-β1通路的直接靶基因;miR-294通过调控RBL1抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。 (2) miR-294可以抑制老年UUO小鼠肾损伤模型的肾间质纤维化,改善肾功能。