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镉（cadmium,Cd）污染涉及全人群,对肾脏、骨骼、肺、生殖系统等均有损害作用。膳食是一般人群（非污染区、非职业、非吸烟人群）镉暴露的主要途径。有研究预测,一般人群镉暴露量在未来几十年呈增加趋势。相关领域专家指出,中国重金属污染健康危害防控与风险评估的研究重点,应该集中于镉的健康风险。镉接触最关键有害效应的认定,是风险评估的首要关键步骤。目前食品中镉限量标准,是以肾损伤作为镉接触最关键有害效应制定的。最近越来越多的流行病学研究和动物研究表明,在引起肾损伤水平以下的低剂量镉暴露,能增加骨质疏松症和骨折的风险。有学者认为应以骨损伤,作为镉接触的最关键有害效应,修改并降低食品中镉限量标准。钙（calcium,Ca）摄入不足也是骨质疏松症的危险因素,一般人群中膳食镉暴露和低钙摄入往往同时存在,人群研究中可能因钙摄入不足,造成对镉致骨毒作用高估。在现有关于肾损伤水平以下的低镉暴露增加低骨密度、骨质疏松症和骨折风险的人群研究中,仅2篇报告了钙的摄入量,且钙的摄入量在902-1081mg间,低于美国医学科学院对50岁以上女性人群钙摄入量的建议值（1000-1200mg）。因此,由于膳食钙摄入不足的混杂,人群研究中肾损伤水平以下低镉暴露与骨骼损伤的关系仍不确定。高钙摄入是人体骨密度的保护因素,生命早期足够钙摄入能获得最佳骨峰值,并降低生命后期骨折的风险。但过量摄入钙也可能产生不良作用,如增加肾结石的相对危险性,影响钙及其它金属元素吸收。因此,在增加钙摄入拮抗镉毒作用时,需注意钙摄入过高可能的健康风险。此外,一般人群中存在少部分个体钙摄入量,接近或超过钙的可耐受最高摄入量（tolerable upper intake level,UL）。而膳食是镉暴露和钙摄入的主要途径,且肾也是镉、钙毒作用的主要靶器官,两者进入机体后可能毒作用相加,但目前尚无整体动物水平相关毒理学资料。一般人群因饮食习惯、膳食结构等原因,膳食镉暴露水平不一。目前在一般人群膳食镉暴露剂量下,钙补充是否对镉致骨损伤有保护效应,以及对哪个水平镉暴露人群有保护效应和效应大小尚无研究报道。此外,以往大多数研究表明钙补充能拮抗镉吸收,但膳食钙摄入与镉吸收之间存在复杂的交互作用,在不同镉暴露剂量下,随钙摄入量的不同可能减少、不影响甚至增加镉吸收。目前在一般人群膳食镉暴露剂量下,能否在安全的钙补充范围内通过增加钙摄入减少镉吸收也不明确。鉴于以上研究的不足、人群研究中技术及伦理学等方面的限制,和上述问题亟待研究的现实意义,本论文通过动物模型,模拟一般人群膳食镉暴露和钙摄入水平,以明确钙补充是否对一般人群膳食镉致骨损伤有保护效应,更准确地估计肾损伤水平以下膳食低镉暴露与骨骼损伤的关系,及了解钙补充对镉骨毒作用的保护效应。主要研究内容如下:参考《食品安全性毒理学评价程序和方法》,采用大鼠饲料添加镉建立动物模型,模拟一般人群膳食镉暴露,进行90天经口毒性试验,除观察一般毒理学指标外,还观察了不同剂量钙补充对钙、铁、锌、铜吸收的影响,获得大鼠一般人群膳食镉暴露剂量下钙补充的最小观察到有害作用剂量（the lowest observed adverse effect level,LOAEL）。然后通过检测大鼠镉吸收相关指标（镉表观吸收率,肝肾镉浓度）,探讨在一般人群膳食镉暴露剂量下,能否通过钙补充减少镉吸收;并对小肠和肾脏钙转运关键蛋白基因表达进行检测,以解释钙补充对镉吸收影响的可能机制。研究结果将为人群钙补充的风险-收益评估提供相关资料。随后进一步通过建立一般人群和污染区人群不同水平膳食镉暴露动物模型,观察钙补充后不同水平膳食镉暴露的骨效应指标变化,以了解钙补充对哪个水平镉暴露人群有保护效应及效应大小。镉暴露动物模型大鼠钙摄入量正常,可以排除因钙摄入不足而高估镉暴露致骨损伤的可能性,再给予钙补充干预,可以排除高钙摄入可能的保护作用,更准确地估计低镉暴露与镉致骨骼损伤的定量关系。随后进一步从FGF23/Klotho轴出发,探讨钙补充对镉致骨毒作用的潜在保护机制。研究结果不仅为镉的风险评估提供相关毒理学资料,也为理解钙对镉骨毒作用的保护效应及机制提供重要的理论依据。第一章一般人群膳食镉剂量下不同剂量钙补充的大鼠亚慢性毒性研究本研究参考《食品安全性毒理学评价程序和方法》,选用清洁级健康断乳雌性Sprague–Dawley大鼠50只,按体重随机分为5组,分别将氯化镉和碳酸钙掺入钙含量适宜饲料（AIN-93G,含0.5%Ca,为大鼠钙适宜摄入量）,连续喂饲90天。既往研究已经证实,以饲料添加1mg/kg镉的方式,给大鼠染毒可以模拟一般人群膳食镉暴露。各组每公斤饲料中加入量（以镉钙计）分别为:0+0（对照组）;1mg Cd/kg+0（镉暴露组）;1mg Cd/kg+0.15%Ca（低钙补充组）;1mg Cd/kg+0.4%Ca（中钙补充组）;1mg Cd/kg+0.6%Ca（高钙补充组）。通过对钙毒作用的靶器官肾进行病理学检查,和氮素氮等生化、血液指标检查,以了解不同水平钙补充的钙毒作用;通过对血清钙、铁、锌、铜,钙、铁、锌、铜表观吸收率,肝肾铁、锌、铜浓度和骨钙含量的检测,以观察不同剂量钙补充对钙、铁、锌、铜吸收的影响,从而确定一般人群膳食镉暴露剂量下,大鼠钙补充的LOAEL。与对照组比较,（1）钙补充各组动物活动、生长正常,实验末体重、总进食量、总食物利用率,以及脏器绝对重量、脏体比差异均无统计学意义（p>0.05）。（2）中、高剂量钙补充组尿素氮升高,差异有统计学意义（p<0.05）,低剂量钙补充组尿素氮差异无统计学意义（p>0.05）,且低、中、高剂量钙补充组间呈剂量-效应关系;（3）低剂量钙补充组病理结果未见明显异常,但在中、高剂量钙补充组肾小管上皮细胞钙化等级和发生率升高,钙补充各组间呈剂量-效应关系,结果与血尿素氮结果一致。（4）低、中剂量钙补充组血常规各指标差异无统计学意义（p>0.05）,高剂量钙补充组白细胞计数,单核细胞计数和淋巴细胞计数的增加,且差异有统计学意义（p<0.05）。（5）低、中剂量钙补充组肝、肾组织铁浓度差异无统计学意义（p>0.05）,高剂量钙补充组肝、肾铁浓度降低,差异有统计学意义（p<0.05）。（6）镉暴露组与对照组比较各项指标均无统计学意义（p>0.05）。根据中钙补充组的肾病理改变和血清尿素氮高于正常组,且各钙补充剂量组之间呈剂量-效应关系,本研究确定对暴露于1mg Cd/kg饲料,雌性大鼠钙补充的LOAEL,低于中钙补充组钙含量（即每公斤饲料+0.4%Ca）,低于文献报道钙单独摄入时的LOAEL值（即每公斤饲料+0.6%Ca）。第二章一般人群膳食镉暴露剂量下不同剂量钙补充对大鼠镉吸收的影响通过对上述动物模型镉吸收相关指标（镉表观吸收率,肝肾组织镉浓度）的检测,及对小肠和肾脏钙结合蛋白基因表达量检测,以明确在一般人群膳食镉暴露剂量下,能否在安全的钙补充范围内,通过钙补充减少镉吸收及可能机制。各钙补充组与镉暴露组比较,低剂量钙补充组肾镉浓度升高,且差异有统计学意义（p<0.05）;但中、高剂量钙补充组肾镉浓度与镉暴露组相比较,差异无统计学意义（p>0.05）。大鼠小肠钙结合蛋白基因表达量与肾镉浓度的变化趋势一致。低钙补充组钙结合蛋白基因表达高于镉暴露组（p<0.05）,中、高钙补充组小肠钙结合蛋白基因表达与镉暴露组相比差异无统计学意义（p>0.05）。一般人群膳食镉暴露剂量下,中、高剂量钙补充并不减少大鼠的镉吸收;且低剂量钙补充能增加镉吸收,小肠钙结合蛋白可能参与了其过程。第三章钙补充对大鼠镉致骨毒作用的干预效应研究建立一般人群和污染区人群膳食镉暴露动物模型,以第一部分实验获得的大鼠钙补充LOAEL（+0.4%Ca含量）为钙干预剂量,进行干预实验,以了解钙补充对哪个水平镉暴露人群骨损伤有保护作用及效应大小。选用雌性断乳后SD大鼠70只,按体重随机分为7组,分别将氯化镉和碳酸钙掺入AIN-93G饲料连续喂饲90天。各组每公斤饲料中加入量（以镉钙计）分别为:0+0（对照组）;1mg Cd/kg+0（低镉暴露组）;1mg Cd/kg+0.4%Ca（低镉暴露钙干预组）;5mg Cd/kg+0（中镉暴露组）;5mg Cd/kg+0.4%Ca（中镉暴露钙干预组）;50mg Cd/kg+0（高镉暴露组）;50mg Cd/kg+0.4%Ca（高镉暴露钙干预组）。在镉暴露指标上,除大鼠平均每日膳食镉摄入量外,还通过原子吸收法检测肾脏,肝脏和股骨中镉含量,以准确估计大鼠镉体内暴露量。在骨效应指标上,除骨量指标外,还从宏观敏感指标骨生物力学,病理学骨微结构、血清骨代谢生物标志物及骨代谢OPG/RANKL通路进行观察,以评估钙补充干预的保护效应。对中、高镉暴露组大鼠,钙补充干预后,股骨弹性模量和抗弯最大应力分别增加25.32%32.8%,9.9%11.2%,血清PINP（骨形成标志物）增加、骨微结构（骨小梁数量和皮质厚度）增加,骨代谢OPG/RANKL通路中OPG基因（成骨相关）和蛋白表达增加（p<0.05）。但对低镉暴露组大鼠,钙补充除增加骨代谢OPG/RANKL通路中成骨相关基因和蛋白表达外,对上述指标没有影响。钙补充对大鼠镉致骨骼损伤有保护效应,特别是对中、高剂量膳食镉暴露大鼠效应显著。但对低剂量镉暴露组大鼠,钙补充除增加骨代谢OPG/RANKL通路中OPG基因和蛋白表达外,对宏观敏感指标骨生物力学没有影响。第四章钙补充对镉致骨毒作用的干预机制研究通过酶联免疫吸附试验,检测上述动物模型血清1,25-二羟基维生素D3,血清Klotho蛋白和FGF23蛋白,实时定量PCR、免疫组织化学染色检测肾组织Klotho基因和蛋白表达;实时定量PCR,免疫组织化学染色和检测Western blot法检测股骨FGF23基因和蛋白表达,及Wnt/β-catenin通路,成骨细胞的增殖分化相关基因和蛋白,从FGF23/Klotho轴,探讨钙补充对镉致骨毒作用的潜在保护机制。钙补充干预后血清Klotho蛋白、肾Klotho基因和蛋白表达降低（p<0.05）;肾钠依赖性磷酸盐协同转运蛋白（Napi2a）基因表达低于干预前（p<0.05）;肾1,25-（OH）2D3合成的线粒体Cyp27b1酶基因表达干预后高于干预前（p<0.05）。钙补充干预后,大鼠股骨FGF23基因和蛋白表达升高（p<0.05）。干预后高镉暴露组骨Wnt/β-catenin通路Wnt靶基因Tcf1和Axin2基因表达增加（p<0.05）;Wnt通路下游与增殖相关的C-myc蛋白表达增加（p<0.05）。干预后骨促进成骨细胞分化的Runx2蛋白上调,反映成骨细胞终末分化水平的Ⅰ型胶原（Col1a1）基因和蛋白表达上调。在血清蛋白、肾基因和蛋白表达层面,钙补充干预后Klotho表达均下调,骨FGF23基因和蛋白上调,推测钙补充可能通过FGF23/Klotho轴发挥其对镉骨毒作用的保护效应。基于肾组织基因和蛋白表达结果,推测这一生物学效应可能与Klotho和FGF23形成特异性受体复合物,间接影响肾脏中的影响维生素D合成、钙的重吸收和肾磷酸盐转运有关;基于骨组织基因和蛋白表达结果,推测其与FGF23/Klotho轴调控成骨细胞中Wnt/β-catenin通路影响成骨细胞的增殖分化有关。综上所述,对暴露于1mg Cd/kg饲料雌性大鼠,钙补充的LOAEL值低于文献报道钙单独摄入时的LOAEL值,结果提示人群中少部分钙摄入量接近或超过UL者,不能忽视膳食镉暴露的毒作用。一般人群膳食镉暴露剂量下,中剂量钙补充,并不减少低镉暴露大鼠的镉吸收,提示减少镉吸收可能不是钙拮抗镉骨毒作用的机制;且低剂量钙补充能增加镉吸收,提示在人群钙补充的风险-收益评估时,需关注钙补充增加镉吸收的潜在不良作用。钙补充对大鼠镉致骨骼损伤有保护效应,提示在镉的风险评估中,需考虑高钙摄入对镉致骨毒作用的保护效应;而对低剂量组大鼠,钙补充除增加骨代谢OPG/RANKL通路中OPG基因和蛋白表达外,对宏观敏感指标骨生物力学没有影响,提示钙补充对镉骨毒作用的保护效应具有一定的范围和剂量选择性。钙补充对镉致骨毒作用的保护机制涉及FGF23/Klotho轴,还直接影响骨代谢OPG/RANKL信号通路。