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一、研究背景胆管癌作为一种常见的恶性肿瘤,发病率在我国消化系统肿瘤中排名第五,其发病率每年仍有增高的趋势。流行病学调查显示胆管癌患者发病年龄多为50-60岁,男性多于女性。胆管癌的发病率具有一定民族和区域分布差异,多发生亚洲,特别是东南亚以及中东国家,我国主要是华南以及东南沿海发病率较高。近些年,随着环境不断恶化以及临床诊断技术的发展进步,世界范围内胆管癌发病率的呈逐年上升趋势。尽管胆管癌的发病率仍低于消化系统其他恶性肿瘤,但是患者的死亡率却一直处于较高水平。胆管癌所处的特殊解剖部位以及高侵袭转移能力,是造成高死亡率的主要原因。目前针对胆管癌的治疗方法中,胆管癌根治性切除术是提高患者预后降低死亡率的主要手段。但是由于胆管癌起病隐匿、临床表现不典型以及缺乏早期诊断标志物,部分患者就诊时肿瘤已经进入晚期,有些甚至已经发生转移,因而失去了手术切除肿瘤的最佳时机。部分胆管癌患者即使接受根治性手术切除,肿瘤复发以及转移的风险仍然偏高。以上这些因素严重影响了胆管癌根治性切除术的远期疗效。近年来,针对胆管癌发生、发展的相关分子机制研究已经取得一定的进展,但是涉及到胆管癌的免疫逃逸以及侵袭转移的相关研究还不是很完善。所以我们把研究的重点放在了胆管癌的肿瘤微环境,特别是免疫逃逸以及侵袭转移的相关研究上。通过相关内容的研究,我们尝试发现新的分子以及相关通路作为诊断和治疗靶点,并且能够为创新临床诊断和治疗的方法提供理论依据。T细胞免疫作为肿瘤微环境中抗肿瘤免疫的重要组成部分,在肿瘤的发生、发展中起到十分关键的作用。其中T细胞的活化和增殖需两种信号途径。第一条信号途径是抗原递呈细胞通过呈递抗原肽并且与T细胞受体识别,传递活化信号。第二条信号途径是通过协同刺激信号分子活化T细胞。协同刺激分子决定了T细胞是被激活并且增殖还是转为抑制或者无应答状态。目前所知的协同刺激分子主要分为三类:肿瘤坏死因子家族、细胞因子家族以及B7家族。其中B7家族包括了B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-DC和B7-H4。B7家族作为重要的协同刺激分子,它们不仅能起到促进T细胞增殖活化以及产生细胞因子的作用,同时也能起到抑制、限制或者减弱T细胞反应的作用。B7-H4作为协同刺激分子B7家族中的成员,主要提供负性调节信号,通过抑制T细胞增殖、分泌相关细胞因子以及降低T细胞杀伤肿瘤细胞能力,从而促进肿瘤细胞逃过宿主免疫监视进而发生免疫逃逸现象;同时,B7-H4在部分肿瘤中特异性表达,还可以增强肿瘤细胞侵袭转移能力,促进肿瘤细胞恶性转化。既往文献报道,B7-H4在多种肿瘤中存在异常表达,并且与肿瘤临床病理指标以及病人预后密切相关。由于B7-H4在协助肿瘤细胞逃避机体免疫监视以及肿瘤发生发展中起到了十分重要的作用。根据既往研究成果以及前期研究结果,我们对B7-H4在胆管癌免疫逃逸中的作用和临床意义进行初步研究,并提出研究假设:B7-H4在胆管癌患者中特异性表达增高,并且通过抑制肿瘤微环境中的免疫淋巴细胞,降低对肿瘤细胞的杀伤能力,从而促进肿瘤细胞发生免疫逃逸。同时B7-H4还可促进胆管癌细胞发生恶性转化,增强癌细胞自身侵袭转移能力。二、研究方法为了验证上述假设,首先,我们通过免疫组化检测统计B7-H4在胆管癌病人中的表达情况,分析其表达水平与临床病理特征以及患者预后的关系,并分析肿瘤组织和非肿瘤组织中B7-H4的差异表达的情况;其次,我们通过免疫组化分别统计肿瘤实质和间质中CD4,CD8阳性T淋巴细胞浸润情况与B7-H4阳性表达之间的联系,分析B7-H4是否抑制T淋巴细胞在肿瘤微环境中浸润的情况;再次,我们在体外试验中干扰B7-H4在肿瘤细胞中的表达,分析B7-H4表达水平的改变对细胞毒性淋巴细胞的杀伤作用和相关细胞因子分泌情况的影响。最后,通过下调B7-H4在胆管癌细胞中表达水平,观察胆管癌细胞侵袭和迁移能力的变化情况。本项研究目的在于探讨B7-H4在胆管癌中的表达情况以及相关临床意义,以及它如何促进胆管癌细胞在肿瘤微环境中发生免疫逃逸以及恶性转化,尤其是增强癌细胞侵袭迁移能力的可能机制,开拓胆管癌发生肿瘤免疫逃逸以及侵袭转移的研究思路,为发现新的胆管癌预后指标以及新的免疫治疗靶点提供科学研究依据。1.收集从2005年至2012年第三军医大学西南医院肝胆外科研究所进行根治性切除并经病理诊断明确为胆管癌的病例。上述收集的病例均未进行放疗或者化疗。同时收集19例慢性胆管炎、8例胆管腺瘤标本和18例胆管癌淋巴结转移组织标本。收集的临床资料包括病人性别、年龄、肿瘤位置、大小、分化程度、分期分级、淋巴结转移以及远处转移的情况。采用免疫组化的方法检测B7-H4在各种组织中的表达情况,并对比肿瘤组织和非肿瘤组织中B7-H4的表达差异;同时分析B7-H4与患者临床病理特征的相关性。2.收集110例胆管癌患者肿瘤组织,进行免疫组化染色,检测统计CD4、CD8阳性T淋巴细胞分别在肿瘤实质以及肿瘤间质组织中的浸润表达情况,并结合对应患者的B7-H4表达情况,分析B7-H4与CD4、CD8阳性T淋巴细胞表达情况的相关性。3.收集110例胆管癌患者临床随访资料(包括患者术后总存活时间和无瘤生存时间)。总生存时间的计算方式是从病人手术时间到病人死亡时间或者最后一次联系随访时间;无瘤生存时间的计算方式是从病人手术时间到发现肿瘤复发的时间。肿瘤的复发主要依靠影像学以及病理诊断为主。单因素生存分析采用KM法(KM method),多因素分析采用Cox多因素逐步回归(向前,极大似然法)。分析B7-H4在肿瘤组织中的表达与患者预后之间的关系。4.选择胆管癌细胞株QBC939和RBE作为研究对象,利用慢病毒作为载体,构建sh RNA-B7-H4序列,下调两株细胞中B7-H4的表达水平,然后将其与细胞毒性T淋巴细胞共培养,观察细胞毒性T淋巴细胞对胆管癌细胞杀伤作用的变化情况。同时我们还检测共培养后培养基上清液相关细胞因子分泌水平的变化情况。5.选择胆管癌细胞株QBC939和RBE作为研究对象,利用慢病毒作为载体,构建sh RNA-B7-H4序列,下调两株细胞中B7-H4的表达水平,然后通过观察两株胆管癌细胞的损伤修复实验、Transwell侵袭实验,观察B7-H4表达对胆管癌细胞侵袭和迁移能力的影响。三、研究结果1.在110例患者的胆管癌组织中,54例呈B7-H4染色阳性,阳性率为49%;8例胆管腺瘤组织中,全部呈B7-H4染色阴性;19例慢性胆管炎组织中,4例呈B7-H4染色阳性,阳性率为21.1%。本部分结果提示:B7-H4在肿瘤组织中表达的阳性率明显高于非肿瘤组织(p=0.023),B7-H4在胆管癌组织中表达异常增高。通过分析B7-H4表达情况和患者临床病理特征的相关性发现:B7-H4的表达与肿瘤分期,分级和淋巴转移有关;而与性别、年龄、部位,远处转移无关。本部分结果提示:B7-H4的异常表达可能与肿瘤恶性程度以及侵袭转移相关。2.在110例患者的胆管癌肿瘤间质组织中,CD4阳性T淋巴细胞轻度浸润97例,重度浸润13例;CD8阳性T淋巴细胞轻度浸润56例,重度浸润54例。在110例患者的胆管癌肿瘤实质组织中,CD4阳性T淋巴细胞轻度浸润88例,重度浸润22例;CD8阳性T淋巴细胞轻度浸润76例,重度浸润34例。胆管癌组织中B7-H4的表达水平与CD8阳性T淋巴细胞在肿瘤间质细胞浸润程度有关。本部分结果提示:B7-H4分子作为一个负性免疫调控分子,可能通过降低CD8阳性T淋巴细胞在肿瘤间质细胞浸润的程度,从而在促进胆管癌细胞发生免疫逃逸中起到重要作用。3.通过对110胆管癌患者生存数据的统计。Kaplan—Meier模型分析提示:B7-H4阳性组患者生存时间明显低于B7-H4阴性组患者(p=0.015)。我们按照相同方法发现:B7-H4阳性组患者复发时间明显低于B7-H4阴性组患者(p=0.045)。为了排除相关混杂因素的干扰,我们将患者年龄、性别、肿瘤部位、分化程度以及B7-H4表达情况带入Cox模型中进行术后存活时间以及复发时间的多因素相关性分析。结果显示:B7-H4阳性表达是判定患者术后存活时间和复发时间的一个相对独立危险因素(HR=1.786,95%CI=1.110-2.872,p=0.017;HR=2.062,95%CI=1.160-3.665,p=0.014)。本部分结果提示:B7-H4阳性表达与胆管癌患者预后较差显著相关而且可以作为判断患者预后的独立分子标志物。4.我们通过Western-blot方法检测,发现:两株胆管癌细胞株QBC939和RBE均有B7-H4蛋白的表达。我们采用慢病毒转染sh RNA-B7-H4进入细胞株,成功下调B7-H4表达水平;在效靶比为(20:1或者10:1)时,特异性CD8+CTL对B7-H4表达水平下调的胆管癌细胞杀伤能力明显高于对照组的杀伤能力。淋巴细胞和B7-H4表达水平下调的胆管癌细胞株混合培养后,TGF-β,IL-6细胞因子分泌水平明显低于对照组。本部分结果提示B7-H4有可通过能增强细胞因子TGF-β,IL-6的分泌水平,诱导CD8阳性T分化为不具有细胞毒性Th17,从而降低CD8+CTL对肿瘤细胞的杀伤能力。5.采用慢病毒转染sh RNA-B7-H4进入细胞株,成功下调B7-H4表达水平;通过观察损伤修复实验、Transwell侵袭实验发现下调胆管癌细胞中B7-H4蛋白表达水平能明显抑其癌细胞侵袭和迁移能力。本部分结果提示:B7-H4明显促进了胆管癌的侵袭和转移。四、研究结论胆管癌中存在B7-H4异常表达,其高表达提示患者预后不良。分析原因可能是B7-H4有可能通过促进肿瘤侵袭迁移,或者通过增强TGF-β,IL-6分泌水平,降低细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,从而促进胆管癌细胞发生免疫逃逸,进而影响患者预后。