论文部分内容阅读
土壤盐渍化是影响农林业生产和生态环境的严重问题。开发耐盐相关基因,利用基因工程培育高度耐盐的植物品种是利用盐渍化土地的有效途径。海滨锦葵具有较强的耐盐性,其耐盐基因的分离与利用对盐渍土利用具有现实意义。本研究以海滨锦葵为材料,利用cDNA-AFLP技术,对盐胁迫下海滨锦葵幼苗根部和叶部的基因表达进行了分析。从40个选择性扩增引物组合中筛选出扩增多态性丰富的28个引物组合用于cDNA-AFLP分析,共产生约1750条TDFs,平均60条TDFs/引物组合。依据每个TDF条带在对照(CK)和盐胁迫处理样品中的有、无和相对强、弱可以划分为4种基本的基因差异表达类型:A)盐胁迫沉默;B)盐胁迫诱导表达;C)盐胁迫上调表达;D)盐胁迫下调表达。
盐胁迫下海滨锦葵幼苗叶部和根部的基因差异表达多以量的变化为主,包括盐胁迫下基因表达上调、下调或随盐处理浓度不同(NaCl浓度1.0％和2.0％)和胁迫时间长短(2h,6h和24h)而波动的差异表达模式;只有少量基因的差异表达表现出质的变化,如盐胁迫下基因沉默或诱导表达;仅在盐胁迫处理2h的海滨锦葵幼苗根部,基因的差异表达以质的变化为主的类型比例略高于量的变化类型比例;盐胁迫应答基因在不同组织中上调、下调、诱导或沉默的比例随胁迫处理时段而动态变化,在较短时间胁迫下基因差异表达的程度较高,而后随胁迫处理时段的延长而渐趋稳定。总体而言,海滨锦葵不同组织在盐胁迫不同阶段的基因时、空、序表达特征并没有固定的程式。
对有差异表达的TDFs进行回收、克隆和测序,利用NCBI蛋白质数据库和核酸数据库进行BLASTX和BLASTN序列比对分析,其中差异表达的38个TDFs中有34个与已知基因有较高的同源性。在盐胁迫下海滨锦葵幼苗中不同组织差异表达基因按照功能可以分为四类:1)负责离子平衡重建和抗胁迫蛋白基因;2)盐胁迫条件下与植物的物质代谢、能量供应相关以及其它与恢复生长和发育相关的基因;3)调控基因表达的转录和翻译调控相关蛋白和转座基因:4)与信号转导相关的基因,例如转导子家族蛋白基因,含有亮氨酸拉链的受体蛋白激酶基因,含有DC1功能域的蛋白基因等。另外4个克隆未有显著相关的同源性片段,说明这4个克隆可能为功能未知的新基因cDNA片段。对6个耐盐相关基因进行的Real time-RT PCR鉴定结果显示与cDNA-AFLP方法的分析揭示的差异表达结果基本一致。
盐胁迫早期Na+/H+反转运蛋白(CHX)基因在盐胁迫下根部的上调表达表明海滨锦葵可能通过区域化Na+到根部组织从而维持顶芽[K+]/[Na+]平衡,达到耐盐的目的。除了维持离子平衡外,海滨锦葵氨基酸转运蛋白类基因在盐胁迫下的转录似乎表明海滨锦葵幼苗还积累小分子物质如氨基酸来维持渗透平衡。海滨锦葵的耐盐机制还可能通过消除活性氧进而减少盐胁迫对植物的损害。以上相互联系的几方面途径可能是海滨锦葵耐盐的主要机制。另外,海滨锦葵在长期的进化过程中,在适应盐胁迫的早期阶段,生长发育相关基因的表达也是海滨锦葵盐胁迫下恢复生长的生存策略。实验中发现的与盐胁迫响应有关的信号转导类基因,包括一些激素调节因子和转录因子,蛋白激酶及其它蛋白质。这些基因的研究报道较少,但研究价值较高,需要进一步探讨。
为了研究植物基因组表观遗传修饰对逆境胁迫下基因差异表达的影响,本实验用MSAP方法分析了盐胁迫处理5天后海滨锦葵根和叶片的基因组DNA胞嘧啶甲基化多态性程度。结果显示:盐胁迫后叶片和根部的基因组DNA胞嘧啶甲基化多态性的变化趋势基本一致;盐胁迫下叶部的基因组DNA胞嘧啶甲基化水平和根部基因组DNA胞嘧啶甲基化水平比对照提高。盐处理后海滨锦葵幼苗在特定部位(根或者叶片)CCGG特定位点胞嘧啶的甲基化改变可能影响基因的表达。由此推测,海滨锦葵叶片和根部基因组DNA胞嘧啶的超甲基化可能是海滨锦葵适应盐胁迫的一种机制。在盐分胁迫下,海滨锦葵通过基因组DNA胞嘧啶超甲基化来适应环境变化,调控内源基因的时空表达,从而进行基因组防御和发育反应,来适应盐胁迫。在对照和盐胁迫处理后CCGG特定位点胞嘧啶的甲基化多态性相关片断中有12个被测序。这些结果为进一步研究海滨锦葵在盐适应过程中的基因组CCGG序列发生甲基化与基因表达调控的关系奠定了基础。