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鳞翅目昆虫广泛的遗传多样性和快速多变的选择进化机制保证其在自然界中具有广阔的生存空间。家蚕作为鳞翅目的模式种类,由于本身具有重要的经济价值,经过5000多年的人工驯养,积累了非常丰富的突变体资源:涉及丝质、抗逆、形态体色和食性等重要性状,甚至也包括人类疾病相关基因的一些突变体。如能在遗传学水平和分子水平上开展深入研究,除了可服务于经济生产,也能成为选择进化、变态发育、天然免疫甚至是人类自身疾病的研究模型。
家蚕易于大规模饲养,而且世代周期短,可方便地用于构建作图群体；此外,家蚕的转基因体系效率、稳定尚远远不能达到植物、果蝇等研究模型的水平。因此在现阶段,以定位克隆为基础的正向遗传学手段是较为理想的研究家蚕突变体性状的手段。本论文将主要介绍在建立定位克隆平台和利用平台分离具体的突变体基因方面的工作,具体来说包括以下内容:
第一,针对现有家蚕SSR标记数量少的问题,在实验室前期工作基础上,于另外的家蚕品系中筛选更多的SSR多态标记；通过在新作图群体中的大规模基因型分析,对新筛选到的标记进行连锁定位,构建遗传连锁图。在这部分工作中,以家蚕品系Fa50B和Nistari为作图亲本,新筛选了269个SSR多态标记,并完成了251个标记的连锁定位。新构建的家蚕SSR遗传连锁图覆盖家蚕28条染色体中的26条,总作图距离达到1859cM。
第二,针对家蚕SSR连锁图密度不高和标记本身多态性低的问题,一方面通过整合不同作图群体的基因分型数据,构建整合图谱,缩短将图上标记的平均间距；另一方面,在已定位的标记周围寻找SSR位点,经扩增确认和多态性检测的临近标记作为图上标记的备选,以解决单一标记多态性不高的问题。在这部分工作中,最终构建了标记总数达到692个的遗传整合图谱,将图上标记的平均间距由7cM提高到4.8cM,并为连锁图上的SSR标记位点开发了497个经确认的邻近标记,其中244个检测到多态性,标记总数超过1000个；此外,通过统计分析,确认了SSR位点的多态性与串联重复单元的相关性。
第三,针对候选区段内精细定位的要求,在家蚕全基因组范围内开发SSR和SNP位点。通过自行设计程序,在家蚕全基因组范围内搜索到2万多个SSR位点,并对各种类型SSR的分布进行了统计分析。通过对菁松和兰10两个家蚕品系的全基因组测序,检测出近20万个SNP位点。以SSR和SNP资源为基础,构建了便于普通用户使用的数据库平台,以此为基础,进一步搭建了研究组的主页和生物信息支撑平台,方便组内定位克隆工作和其他日常工作的需求。
第四,利用现有家蚕定位克隆平台,完成了家蚕体色突变体mln的定位克隆。并通过表达谱和表型之间的关联分析、靶标基因的系统进化分析、突变体酶活检测和靶标基因干涉,验证了结论的可靠性,并结合相关文献报道对昆虫的体色决定机制进行了讨论。研究结果发现家蚕的一种乙酰转移酶基因的突变导致了体色突变体mln的形成--突变体中该基因位点在编码区的缺失产生移码突变,失去活性的突变体乙酰转移酶无法在黑色素代谢途径中发挥正常作用,导致黑色素的过量沉积。家蚕mln突变体是发现的第一个关于乙酰转移酶参与昆虫体色决定的表型证据,而在此之前,乙酰转移酶是整个黑色素代谢途径中唯一一个还没有报道对应表型的酶。此外,mln也是本实验室第一个成功分离的家蚕突变体位点。