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随着核电站的建立，人类太空活动的增加，临床上放射诊疗设备的广泛应用，以及核武器恐怖威胁等因素的存在，人类的辐射暴露性可能性日益增加。造血系统对电离辐射(IR)高度敏感，辐射引起的急性骨髓抑制是造成急性放射病中感染、出血、贫血等临床表现的重要病理基础。临床上，可以给予造血细胞因子缓解症状，其中粒细胞集落刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）是应用最广泛的药物。 长期骨髓抑制是辐射远期损伤的主要表现，也是临床进行肿瘤放疗、化疗时最常见的毒副作用之一，直接影响到治疗效果及患者的生存质量。长期骨髓抑制具有迟发性，在临床上容易被忽视，目前尚无有效治疗手段，所以机制研究对长期骨髓抑制的预防和治疗具有重要的意义，是造血干细胞研究关注的热点之一。 G-CSF可以促进HSC及粒系前体细胞的增殖和分化，缓解受照后急性骨髓抑制。但是有临床观察显示接受放疗、化疗的患者应用G-CSF后骨髓的恢复能力下降，提示G-CSF可能促进造血干细胞(HSC)的增殖分化但损伤了其自我更新能力。G-CSF对造血干细胞辐射损伤的影响及其机制的研究对G-CSF临床救治骨髓抑制的合理使用具有重要的意义。 辐射诱导的组织细胞内自由基水平升高是造血系统损伤的重要分子机制。氧化应激中的活性氧或活性氮可以诱导DNA和脂质损伤，蛋白质氧化等，其中应激反应中产生的NO及过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等可以造成多种细胞的病理性损伤。应激产生的NO主要由诱导型NO合酶(Inducible NO Synthase，iNOS)介导。前期研究结果显示，iNOS的特异性抑制剂可以减轻辐射引起的血管内皮损伤。阐明iNOS在辐射导致的组织、细胞损伤中的作用，对辐射损伤的分子机制的研究具有重要的意义。 为探讨G-CSF对造血干细胞辐射损伤的影响及其机制，课题第一部分利用4Gy，6Gy亚致死剂量造血系统辐射损伤模型，给予G-CSF治疗检测其对造血干细胞的影响;采用对小鼠受照后30天生存率保护作用最佳给药方案。一个月后检测外周血和骨髓细胞数目，骨髓细胞分型，造血祖细胞集落形成能力(CFU-GM)，LSK细胞中活性氧(ROS)，p38MAPK和p16表达水平的变化。同时移植骨髓细胞进行连续竞争性移植实验。实验结果显示，G-CSF可以有效缓解辐射引起的外周血白细胞降低和造血祖细胞增殖抑制，G-CSF对受照小鼠的骨髓细胞计数和骨髓细胞分型影响不大，但是却加重了造血干细胞多系再植能力和自我更新能力的损伤;机制研究发现CSF损伤作用主要是进一步提高了辐射诱导的氧化应激通路ROS-p38的表达，造血干细胞的衰老。提示在应用G-CSF救治急性辐射损伤应采取相应的策略防治骨髓功能的远期损伤。 为阐明iNOS在辐射导致的组织、细胞损伤中的作用，课题的第二部分利用inos-/-小鼠观察iNOS对辐射诱导的造血系统辐射敏感性和损伤恢复的影响。C57小鼠作为野生对照(WT)。实验结果显示，电离辐射可以诱导inos-/-小鼠骨髓细胞凋亡和造血细胞功能减退。ino s-/-小鼠接受6Gy全身照射(TBI)14天后可以引起外周血细胞和骨髓细胞计数降低，HPC，HSC，LSK细胞比例和数目降低，造血祖细胞和造血干细胞功能损伤，破坏造血干细胞稳态。但是，WT小鼠和inos-/-小鼠相比没有显著性差别。表明inos基因缺陷对造血细胞体外照射和小鼠TBI引起的辐射损伤和和辐射损伤恢复没有明显影响。提示可能IR引起氧化应激主要是增加了ROS从而造成DNA损伤和细胞凋亡和衰老等，与炎症通路激活诱导iNOS表达产生大量NO从而造成细胞毒性作用有所区别，也可能是辐射诱导的造血系统多通路损伤作用掩盖了NO的缺失引起的细胞毒性作用。 综上所述，根据临床G-CSF应用发现的问题，探讨了G-CSF对造血干细胞功能的影响和其机制，提出G-CSF可以进一步加重辐射诱导的造血干细胞衰老，加重HSC的功能损伤，提示在临床应用G-CSF救治急性辐射损伤的同时，应考虑采取相应的策略防治骨髓功能的远期损伤。为进一步研究造血系统辐射损伤的机制，利用缺陷小鼠，探讨诱导性一氧化氮合酶的作用，为造血系统辐射损伤防护提供研究思路和理论依据。 主要进行诱导型一氧化氮合酶对造血系统辐射损伤的影响的研究。 目的:辐射诱导的急性骨髓损伤会降低外周血细胞数目，白细胞和血小板的减少，快速增殖的造血祖细胞和少量造血干细胞的凋亡引起急性骨髓抑制，会增加辐射损伤的发病率和死亡率。前期研究显示，诱导型NO合酶（Inducible NO Synthase，iNOS）的抑制剂具有辐射保护作用。UBV可以诱导iNOS表达，iNOS特异性抑制剂可以缓解辐射引起的血管内皮损伤。提示iNOS可能在辐射导致的组织、细胞损伤中发挥作用参与到辐射损伤中。但是，IR是否诱导造血系统中iNOS的表达，以及iNOS对辐射诱导的造血系统损伤有何影响，目前并没有相关课题的研究。基因敲除小鼠的应用有助于探究辐射损伤分子机制，为寻找造血辐射损伤靶向特异性防治手段提供有效的支持。本实验利用ino s-/-小鼠，探究iNOS对造血系统辐射损伤敏感性和辐射损伤恢复的影响。 方法:体外实验，观察inos-/-小鼠和野生型C57小鼠(C57)骨髓细胞受到1Gy，2Gy，4Gy不同剂量电离辐射(ionizing radiation，IR)细胞凋亡和集落形成能力，检测inos基因缺陷对骨髓细胞的辐射敏感性的影响。体内实验，inos-/-小鼠和野生型C57小鼠(C57)分别接受假照射和6Gy的全身照射(TBI)，剂量率为1.08Gy/min，接受假照射的C57小鼠为野生型对照组(WT)，接受6Gy照射的C57小鼠为6Gy照射组(WT6Gy);接受假照射和6GyTBI的inos-/-小鼠分别为inos-/-组（inos-/-）和inos-/-6Gy组(inos-/-6Gy)。接受TBI14天后检测inos-/-小鼠和野生型C57小鼠外周血和骨髓细胞计数，骨髓细胞分型，造血祖细胞和造血干细胞功能以及细胞周期，观察inos基因缺陷对辐射损伤敏感性和造血辐射损伤恢复的影响。 结果:在体外实验中，inos-/-组和WT组的BMMNCs体外接受1Gy，2Gy，4Gy的电离辐射，12h后出现凋亡，呈剂量依赖性。在1Gy，2Gy和4Gy剂量照射条件下，inos-/-小鼠和WT小鼠无论是在HSC还是在HPC中，细胞凋亡率均无显著性差异。体外的CFU实验显示，2Gy，4Gy体外电离辐射均可以明显的降低小鼠骨髓细胞的CFU-GM，BFU-E，和CFU-GEMM(P＜0.05)，体外接受2Gy，4Gy电离辐射的inos-/-小鼠和未接受照射的inos-/-小鼠相比，也明显的降低了CFU-GM，BFU-E，和CFU-GEMM(P＜0.05)。但是WT和inos-/-小鼠相比，接受了不同剂量照射(0Gy，1Gy，2Gy，4Gy)后各组的CFU-GM，BFU-E，和CFU-GEMM均无显著性差异(P＞0.05)。inos基因缺陷对辐射诱导的造血祖细胞增殖抑制没有显著性影响。体内试验结果显示，6Gy TBI可以引起inos-/-小鼠和WT小鼠外周血细胞和骨髓细胞计数降低，HPC，HSC，LSK细胞比例和数目降低，造血祖细胞和造血干细胞功能损伤，破坏造血干细胞稳态。6Gy的TBI可以诱导不同亚群造血细胞进入细胞周期。但是，进一步的实验结果显示，无论是0Gy还是6Gy照射，WT小鼠和inos-/-小鼠相比都没有显著性差别。 结论:实验结果表明，inos基因缺陷对造血细胞体外照射和小鼠TBI引起的辐射损伤和和辐射损伤恢复的没有明显影响。提示了可能IR引起氧化应激主要是增加了ROS从而造成DNA损伤和细胞凋亡和衰老等，与炎症通路激活诱导iNOS表达产生大量NO从而造成细胞毒性作用有所区别，也可能是辐射诱导的造血系统多通路损伤作用掩盖了NO的缺失引起的细胞毒性作用。