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中药茯苓(Poria cocos)是多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,具有利水渗湿、健脾宁神等功效。茯苓皮是茯苓的表皮,性味与茯苓相同,但茯苓皮利水消肿的功效强于茯苓。四环三萜类和多糖类化合物是茯苓的主要化学成分和活性成分,四环三萜类化合物是茯苓皮的主要化学成分和活性成分。茯苓、茯苓皮及其组成的中药复方五苓散等在临床常用于治疗慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD),但其药效物质基础和作用机制尚未阐明,阻碍了它们的临床应用和药物开发。肾间质纤维化是CKD的共同病理特征,抑制纤维化对干预进展性的CKD有重要意义。本文分离出了茯苓和茯苓皮中改善CKD和抗肾间质纤维化的主要成分茯苓酸A(Poricoic acid A,PAA),探讨了PAA抗肾间质纤维化的作用及其机制。进一步鉴定了参与进展性CKD的生物标志物和探讨了五苓散对生物标志物的作用,发现了干预CKD的药物靶点,探讨了PAA对该靶点的作用及机制。目的:1.探讨PAA对肾间质纤维化进程中的氧化应激与炎症、成纤维细胞活化、上皮-间质细胞转分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)沉积的作用及机制,明确PAA干预CKD的作用及抗肾间质纤维化的分子生物学机制。2.鉴定进展性CKD的生物标志物,评价五苓散对生物标志物的影响,揭示五苓散干预CKD的生物化学作用机制。3.鉴定参与进展性CKD的关键分子,阐明PAA对该分子的作用及机制,揭示PAA抗肾间质纤维化的作用靶点,为抗肾间质纤维化的药物开发提供实验依据和理论基础。方法:将茯苓皮粉碎,经乙醇提取、乙酸乙酯萃取、MCI柱分离和反相色谱分离后,得到PAA。基于PCR、western blots、免疫荧光染色、免疫组织化学染色、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀等技术和方法,采用体内动物模型[5/6肾切除(5/6 Nephrectomy,Nx)、肾缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)、单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)、腺嘌呤诱导肾衰竭等]和体外细胞模型[缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导肾上皮细胞NRK-52E和HK-2模型、TGF-β1诱导的HK-2和NRK-52E模型、成纤维细胞NRK-49F模型等],评价PAA对肾间质纤维化的作用及机制。采用代谢组学和生物信息学结合的方法,鉴定并评价临床中与CKD进展及五苓散疗效相关的生物标志物。结果:1.PAA的分离与结构鉴定。从茯苓皮中分离得到PAA,经核磁共振波谱、质谱等鉴定PAA的结构。2.PAA通过上调AMPK活性、选择性阻断Smad3磷酸化抑制成纤维细胞活化。PAA增强Nx和UUO模型中AMPK的活性,进而抑制成纤维细胞活化和ECM重构。PAA选择性阻断AMPK下游的Smad3与TGFβRI和SARA的结合而抑制Smad3磷酸化,减轻肾间质纤维化,证明PAA上调AMPK活性减轻肾间质纤维化。而PAA对p-Smad2、Smad2、Smad4和Smad7的抑制作用较弱。3.PAA通过调控Gas6/Axl-NF-κB/Nrf2信号通路改善氧化应激与炎症。PAA、褪黑素以及二者联用显著抑制肾IRI导致的肌酐和尿素水平的上调,抑制上皮细胞损伤,减轻肾间质纤维化,同时延缓IRI诱导急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)到CKD转变。PAA和褪黑素通过调节Gas6/Axl信号通路的异常发挥抗肾间质纤维化作用,同时抑制Gas6/Axl信号通路下游的IκB/NF-κB信号通路活化和Keap1/Nrf2信号通路失活。4.PAA通过抑制TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin信号通路及其相互作用而抑制EMT和ECM沉积。PAA选择性抑制肾IRI诱导肾组织中Smad3的磷酸化,而对其他Smad蛋白和非Smad通路的抑制作用较弱;褪黑素不仅抑制Smad2和Smad3磷酸化、上调Smad7表达,还能抑制ERK、p38和PI3K的磷酸化。PAA的抗肾间质纤维化作用依赖于Smad3的表达水平。PAA和褪黑素还抑制Wnt/β-catenin信号通路活性及其下游促纤维化靶基因的表达。此外,褪黑素抑制Smad2和Smad3与β-catenin的相互作用,而PAA选择性抑制Smad3与β-catenin的相互作用。5.5-甲氧基色氨酸(5-Methoxytryptophan,5-MTP)等5个代谢产物可用于进展性CKD的诊断和五苓散的临床疗效评价。采用代谢组学和生物信息方法研究临床大规模血清样本,鉴定5-MTP等5个代谢产物可作为进展性CKD生物标志物。血清5-MTP水平随CKD进展而降低。进一步验证实验证明这些生物标志物具有高灵敏度和特异性。它们可用于五苓散等药物的临床疗效评价,在生物化学水平揭示CKD的发病机制及五苓散的干预机制。6.色氨酸羟化酶-1(Tryptophan hydroxylase-1,TPH-1)是潜在的CKD治疗靶点。5-MTP及其调控TPH-1均有改善肾功能及抗肾间质纤维化作用,其中TPH-1可被开发为改善CKD的药物靶点;PAA通过调节TPH-1而抗肾间质纤维化。5-MTP通过调控IκB/NF-κB和Keap1/Nrf2信号通路而抑制抗肾间质纤维化。TPH-1是体内合成5-MTP的调控酶,TPH-1的表达随CKD进展而降低。TPH-1过表达增加5-MTP水平,调控IκB/NF-κB和Keap1/Nrf2信号通路及Wnt/β-catenin信号通路抗肾间质纤维化。TPH-1缺陷加剧氧化应激与炎症,加重肾间质纤维化,而TPH-1过表达抑制氧化应激与炎症,减轻肾间质纤维化。PAA干预能上调TPH-1的表达而抗肾间质纤维化。结论:本文研究了PAA干预抗肾间质纤维化的分子生物学和生物化学作用机制,揭示PAA通过调控Gas6/Axl、IκB/NF-κB、Keap1/Nrf2、AMPK、TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin等信号通路而抑制氧化应激与炎症、成纤维化活化、EMT和ECM沉积,发挥抗肾间质纤维化作用。TPH-1可作为干预CKD和抗肾间质纤维化的药物靶点。PAA通过上调TPH-1的蛋白表达而抗肾间质纤维化。本研究揭示了PAA干预CKD和抗肾间质纤维化的作用及分子生物学和生物化学作用机制,为PAA的药物开发提供了理论基础和实验依据,同时为茯苓、茯苓皮及复方五苓散干预CKD和抗肾间质纤维化的物质基础及作用机制研究提供了参考依据。