shRNA沉默YAP表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响

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Hippo信号通路在器官发展过程中主要通过的细胞增殖和凋亡控制器官大小。此信号通路在哺乳动物体内高度保守,在人类的癌症发生过程中其通路的许多信号分子缺失并促进了癌症的发生,暗示其组件具有抑制肿瘤的作用。Yes相关蛋白(YAP)作为其下游负性调控最重要的转录共激活因子,Hippo信号通路失调,YAP磷酸化减少,活性增加进入细胞核,促进细胞增殖、抑制凋亡的相关基因转录增加,从而参与了肿瘤的发生。目的:本实验通过shRNA(shorthairpinRNA)抑制YAP基因的表达,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721的增殖、凋亡、周期及迁移能力的影响。方法:以人YAPmRNA编码区中的四条序列作为RNA干扰靶点,分别构建四个真核表达载体质粒shRNA-YAP-1、shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-3、shRNA-YAP-4,用阳离子聚合物瞬时转染法,在293T细胞中筛出两组干扰效果较好的质粒,将它们分别瞬时转染肝癌细胞SMMC-7721。运用实时荧光定量PCR和Westernblot法检测YAPmRNA和蛋白表达水平的变化;MTT法检测细胞增殖情况,并绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的改变;细胞划痕实验观察细胞迁移能力。结果:运用实时荧光定量PCR和Westernblot法检测到肝癌细胞SMMC-7721中YAP的mRNA和蛋白表达水平较未转染组均降低。MTT实验和细胞划痕模型显示,shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4两组细胞生长明显抑制,细胞迁移减慢;流式细胞术显示,转染48h后,shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4转染组SMMC-7721细胞凋亡数(12.01%±0.81、5.03%±1.01,P<0.05)明显高于空质粒转染组(2.89%±0.08),并且细胞被阻滞在G2期,G0/G1期出现DNA亚二倍体峰。结论:本实验运用shRNA干扰技术,可以有效的干扰肝癌SMMC-7721细胞YAPmRNA表达并能降低YAP的生成,抑制SMMC-7721细胞的增殖和迁移、促进细胞的凋亡。
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