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随着生活水平的提高，生活方式西方化及人口老龄化，人类健康面临的慢性疾病威胁正日益加重，其中糖尿病及其慢性并发症更是危害健康的无情杀手。已证实长期高血糖通过多种方式引起骨代谢紊乱，如糖毒性、高渗性及晚期糖基化终产物(AGEs)等。体外实验也表明，高浓度葡萄糖对成骨细胞的增殖、分化和矿化产生明显的抑制作用。骨保护素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及核因子-κB受体活化因子(RANK)是近年来发现的调控破骨细胞分化激活的细胞因子，其在骨代谢中起重要作用。在骨组织中，成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞的分化和激活，并抑制破骨细胞的凋亡。由成骨细胞分泌的OPG可与RANKL结合，竞争性抑制RANKL与RANK的结合，减少破骨细胞生成，发挥抗骨质疏松的作用。二甲双胍（metformin,MET）作为治疗糖尿病的一线药物，其通过激活AMP激活蛋白激酶（activated protein kinase,AMPK）信号系统发挥降糖作用。新的研究表明二甲双胍能够降低1型及2型糖尿病患者骨折的发生率，对骨骼产生有益影响，其具体机制可能为二甲双胍激活AMPK信号通路继而引起内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide sythase, eNOS)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达增加，影响成骨细胞的增殖、分化和矿化过程，对骨代谢发挥一定保护作用。本实验中我们观察高糖环境对成骨细胞增殖、分化及矿化标志物、相关基因表达的影响，以及二甲双胍干预后相应基因表达的变化，进一步探讨在高糖环境中二甲双胍对成骨细胞代谢的保护作用。一、葡萄糖对成骨细胞MG63增殖及相关基因表达的影响目的探讨不同浓度葡萄糖对成骨细胞MG63增殖的影响及细胞相关基因表达的变化。方法(1)以不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3、5.5/16.7、5.5/33.3mmol/L)干预细胞MG63为干预组，设磷酸缓冲盐溶液(PBS)为对照组，应用细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖；(2)以不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干预细胞MG63为干预组，同时设磷酸缓冲盐溶液(PBS)为对照组，应用生化分析仪检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的含量；(3)以不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干预细胞MG63为干预组，同时设磷酸缓冲盐溶液(PBS)为对照组，应用RT-PCR检测Ⅰ型胶原(COLⅠ)、骨钙素(OCN)、骨保护素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)基因的表达。结果(1)收集葡萄糖作用3天后的MG63细胞株，CCK-8法检测结果显示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖组抑制细胞增殖(P<0.05)，且5.5/16.7mmol/L、5.5/33.3mmol/L葡萄糖交替培养组抑制作用更明显(P<0.01)，而5.5mmol/L葡萄糖浓度组无显著变化；(2)不同浓度葡萄糖分别干预MG63细胞6、12、18天后，检测细胞内ALP的活性，结果显示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖组细胞表达ALP均降低(P<0.05)，尤其在第6、12天时，33.3mmol/L组变化较显著(P<0.01)；(3) RT-PCR结果显示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖组OPG、OCN表达下调(P<0.05)，尤其在33.3mmol/L浓度时更显著(P<0.01)；而RANKL在33.3mmol/L时表达上调(P<0.05)，COLⅠ无明显变化(P>0.05)。结论高糖及波动性高糖明显抑制成骨细胞增殖，高糖环境可下调成骨细胞内ALP活性、OCN基因的表达，表明高糖可减少成骨细胞数量，同时减缓成骨细胞基质成熟、矿化，从多个阶段减弱成骨细胞的成骨能力。进一步的实验结果显示，高糖下调OPG的表达、上调RANKL的表达，使OPG/RANKL比值下降，从而激活破骨细胞，促进破骨细胞的分化、成熟，加快骨吸收，可能是糖尿病性骨质疏松的重要发病机制之一。二、二甲双胍对高糖介导的成骨细胞MG63增殖及相关基因表达的影响目的观察二甲双胍对高糖介导下成骨细胞MG63增殖及相关基因表达的影响，探讨高糖环境中二甲双胍对骨代谢的保护作用。方法(1)实验分组均以不同浓度二甲双胍(0、200、300、400μmol/L)干预高糖(16.7mmol/L)环境中MG63；（2）应用CCK-8检测成骨细胞增殖；(3)应用生化分析仪检测成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)的含量；(4)应用RT-PCR法检测细胞Ⅰ型胶原(CoL Ⅰ)、骨钙素(OCN)及基质金属蛋白酶(MMPs)的表达；结果(1) CCK-8结果显示：各浓度组细胞生长较高糖对照组均显著增加(P<0.01)，提示二甲双胍可逆转高糖环境对成骨细胞增殖的抑制；(2) SFBC速率法检测显示：ALP活性较对照组有所增加(P<0.05)，尤其是第6天及第12天200、300μmol/L二甲双胍组ALP活性增加较显著(P<0.01)，表明二甲双胍可能增加成骨细胞骨形成周期中ALP活性；(3) RT-PCR实验结果显示：二甲双胍干预后COLⅠ、OCN表达上调(P<0.05)，其中COLⅠ在400μmol/L二甲双胍、OCN在300μmol/L二甲双胍组时表达最高(P<0.01)；MMP-1、MMP-2、MMP-3表达较对照组均有下调(P<0.05或P<0.01)，MMP-8表达在400μmol/L MET组表达下调(P<0.05)。结论二甲双胍在一定浓度范围内可逆转高糖对成骨细胞增殖的抑制，上调成骨细胞分化标志物ALP、CoLⅠ、OCN表达，提示二甲双胍可促进成骨细胞增殖、基质成熟、矿化，同时我们实验观察到二甲双胍不同程度抑制MMP-1、-2、-3、-8表达，推测二甲双胍可抑制成骨细胞基质金属蛋白酶MMPs表达从而减少成骨细胞外胶原基质的降解，对高糖环境中骨代谢起保护作用。