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研究背景光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)是上世纪七十年代末开始形成的一项肿瘤治疗新技术,目前已得到美国、英国、德国、法国、日本等不少国家政府相关部门的正式批准,成为肿瘤治疗的一项常规手段。截至目前,这一疗法已成功地用于治疗膀胱癌、前列腺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌、恶性胸膜间皮瘤、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、颅内肿瘤、皮肤肿瘤等恶性肿瘤。而且在对PDT的研究中,研究者们还进一步将其应用扩展到治疗很多非肿瘤性疾病如鲜红斑痣、年龄相关性黄斑变性、消化道粘膜血管病变、尖锐湿疣、痤疮、牙周病等。PDT的治疗基础是光动力作用,它需要具备三个基本要素：光敏剂(Photosensitizer)、激发光(Light)与分子氧(Oxygen)。PDT治疗肿瘤的基本原理是系统或局部给予的光敏剂在各组织中的半衰期不同,一段时间后肿瘤组织中光敏剂浓度明显高于正常组织,形成光敏剂在肿瘤组织的选择性滞留,在特定波长激发光的作用下,同时在分子氧存在的情况下,产生单线态氧(singlet oxygen)及其它活性氧类物质(reactive oxygen species, ROS),导致肿瘤细胞坏死和凋亡；其次,PDT还能破坏肿瘤组织中的微血管,造成局部缺血缺氧导致细胞死亡；最后,PDT可诱导多种免疫细胞快速浸润至肿瘤局部、活化补体系统以及促使多种细胞因子／化学因子的产生和释放,最终启动机体免疫应答反应来杀伤肿瘤。光动力学疗法因具有创伤小、毒性小、选择性好、可消灭隐性癌灶、可保护容貌及重要器官功能、重复性好等优点而在临床实践中获得越来越多的关注。但不可否认的是,PDT作为一种肿瘤微创治疗方法有其自身的局限性,如肿瘤杀伤深度有限、光敏剂的光毒性反应使患者治疗后需要避光、激活机体的免疫功能效率不高、肿瘤消退后复发等。如何提高PDT的疗效是临床亟待解决的现实问题。对于早期肿瘤,手术切除一般可以获得治愈。但对于晚期无法手术切除的患者,目前一般选择放疗和／或化疗,但放疗和化疗手段对肿瘤没有选择性,在杀伤肿瘤细胞的同时也会对机体的正常组织细胞造成损伤,对于晚期患者放疗和化疗的目的一般也只是起姑息治疗作用。肿瘤转移是造成治疗失败和患者死亡最主要的原因,光动力疗法作为一种局部治疗手段,对转移瘤往往是无能为力的。理想的肿瘤治疗方法应该是不仅能清除原发的肿瘤病灶同时还能清除转移病灶。PDT治疗后局部发生炎症反应,中性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞浸润至肿瘤局部,并释放各种细胞因子,吞噬肿瘤细胞及裂解的肿瘤细胞碎片,并将肿瘤抗原递呈给树突状细胞及其它抗原递呈细胞,产生特异性免疫应答。不过晚期肿瘤患者的免疫功能多处于抑制状态,仅由PDT产生的免疫应答反应作用是有限的。故此需要额外的免疫刺激增强PDT产生的免疫效应,增强其杀伤肿瘤的效应。在对光动力疗法的探索中,研究者们还将PDT和其它治疗方法结合,以期达到更好的治疗效果,这其中就包括对PDT和免疫疗法结合的探索,并且研究者们将此联合治疗方法命名为光动力免疫疗法(Photodynamic immunotherapy, PDIT)。有研究报道的跟PDT结合的免疫方法包括免疫佐剂、单克隆抗体、细胞因子、补体激活剂、免疫细胞等。而且结果显示,联合治疗能提高PDT的疗效。激光免疫疗法(Laser immunotherapy, LIT)也是光动力免疫疗法里面的一种,它是将PDT和免疫佐剂相结合的肿瘤综合治疗新方法。其作用机制是特定波长的激光通过光纤定向辐照于肿瘤组织,继而激活肿瘤组织中的光敏剂,发生光热、光化学反应,在一定范围内破坏、杀死肿瘤细胞；同时注射于肿瘤组织中的免疫佐剂能够与从破坏的肿瘤细胞中释放出的各种抗原成分结合,形成疫苗,从而诱导针对肿瘤细胞的免疫反应,杀灭原发肿瘤和转移瘤,产生肿瘤特异性免疫力。激光免疫疗法中应用的免疫佐剂或称免疫调节剂能增强PDT的免疫效应,作为一种新型肿瘤治疗方法,远期疗效好,在恶性肿瘤治疗上展现出很好的应用前景。研究目的本课题我们设计在小鼠H22肝癌模型上,观察不同光照剂量光动力疗法对H22肿瘤的疗效,为后续实验剂量参数提供依据；并对比PDT和以糖基化聚氨基葡糖(glycated chitosan, GC)为免疫佐剂的LIT的疗效,对经LIT治愈的小鼠再次接种同一肿瘤细胞,观察是否有肿瘤形成及其生长情况,探讨LIT的长期抗瘤效应；同时通过建立小鼠皮下双侧肿瘤模型,仅对一侧肿瘤进行治疗,观察对侧未治疗肿瘤的生长情况,探讨LIT的全身抗肿瘤效应；最后对LIT抗肿瘤机制进行分析,为其临床应用提供实验依据。研究方法和内容(一)不同光照剂量光动力疗法对H22疗效研究以4-6周龄、体重18-22g昆明种小鼠为实验对象,于其臀部皮下接种小鼠H22肝癌细胞,5-7天后,选择瘤体直径7-9mm,瘤体无破溃荷瘤小鼠。以Photofrin为光敏剂,波长630nm半导体激光仪为光源,按光照剂量,将小鼠分为空白组、30J/cm2、60J/cm2、90J/cm2、120J/cm2、150J/cm2六组,每组小鼠4只。空白组不做任何处理,5个PDT组于激光照射前24h尾静脉注射光敏剂Photofrin (5mg/kg),光照后每天观察肿瘤及皮肤变化情况,同时游标卡尺测量肿瘤大小,每周3次,观察至治疗后21天。(二)PDT和LIT治疗小鼠H22肿瘤疗效对比按上述方法建立昆明小鼠皮下H22肝癌模型,将小鼠分为空白对照组、PDT组和LIT组,每组10只。光敏剂为Photofrin,给药剂量及方法同上,PDT组和LIT组光照剂量为120J/cm2(功率300mW,时间12min,光斑直径1.5cm),LIT组在光照后即刻给予1%GC0.2ml瘤内注射。治疗后每天观察肿瘤及皮肤变化情况,并监测肿瘤大小,每周3次,肿瘤消失小鼠继续观察,3个月仍无肿瘤复发者视为治愈。对治愈小鼠,再次接种H22肿瘤细胞,观察是否有肿瘤生长及其增长情况。(三)激光免疫疗法的全身抗肿瘤效应研究以4-6周龄、体重18-22g昆明种小鼠为实验对象,于其双侧臀部皮下接种小鼠H22肝癌细胞,建立昆明小鼠皮下转移瘤模型。将小鼠随机分成PDT组和LIT组,每组8只。光敏剂及免疫佐剂剂量及给药方法同上,仅对右侧臀部肿瘤进行激光照射,LIT组光照后将GC注射于右侧肿瘤内,左侧肿瘤不做处理,观察记录双侧肿瘤变化生长情况。研究结果(1)不同光照剂量PDT对H22疗效：各组治疗前肿瘤大小无明显差异(P=0.995)。30J/cm2、60J/cm2组与空白组相比,肿瘤生长速度无明显差异,不能达到治愈H22肿瘤的疗效；90J/cm2、120J/cm2、150J/cm2与空白组相比,肿瘤生长速度有显著减慢(P<0.01),90J/cm2组无治愈小鼠,120J/cm2组有1只小鼠获得治愈,150J/cm2组有3只小鼠治疗后肿瘤消失,不过其中1只肿瘤消退后11天后复发。(2)PDT和LIT对小鼠H22肿瘤疗效：PDT组、LIT组与空白组相比,肿瘤生长速度显著减慢(P<0.01),LIT组肿瘤生长速度与PDT组相比亦有显著差异(P=0.016)。空白组所有小鼠肿瘤不会自动消退,PDT组有2只小鼠获得治愈,LIT组有7只小鼠获得治愈,各组比较有显著差异(P=0.028)。PDT组治愈的2只小鼠再次接种H22肿瘤细胞,肿瘤出现时间延迟,生长速度有所减慢,不过它们最终还是有肿瘤形成。LIT组7只治愈小鼠再次接种H22肿瘤细胞,有5只小鼠未见肿瘤形成,有肿瘤形成的2只小鼠肿瘤出现时间也有延迟,且生长速度减慢。(3)LIT的全身抗肿瘤效应：PDT组小鼠,仅光动力治疗的右侧肿瘤生长受抑制(P<0.01),左侧未治疗肿瘤与空白组小鼠比较无明显差异(P=0.787)。LIT组小鼠,接受治疗的右侧肿瘤生长受到明显抑制(P<0.01)；未治疗的左侧肿瘤生长与空白组比较也有显著减慢(P<0.01);LIT组左侧未治疗肿瘤抑制情况跟PDT组右侧肿瘤相似(P=0.56)；且有3只小鼠不仅右侧肿瘤消失,左侧肿瘤也消失,长时间观察未见肿瘤复发。研究结论PDT治疗小鼠H22肝癌需要达到一定的能量密度才能获得治愈效果；以GC为免疫佐剂的激光免疫疗法能增强PDT对小鼠H22肝癌的抗肿瘤效应,LIT治疗后,小鼠获得肿瘤特异性免疫力,而且LIT不仅对照射部位的局部肿瘤有效,对未治疗的局部转移灶也有疗效,提示该疗法可能成为一种有效的肿瘤治疗新方法。