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目的：
肺癌是一种高发病率的肿瘤，并且已成为癌症死亡的主要原因，有资料显示，2000年以来我国的肺癌的发病率呈显著上升的趋势，目前我国每年的肺癌死亡人数可达60万，居所有恶性肿瘤之首，其中，超过75％的是非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)，NSCLC5年生存率只有15％，疗效进展十分缓慢。因此，对NSCLC发病机制及其预防对策的研究具有十分重要的意义。SCF(Skpl-Cull-F-boxprotein)和后期促进复合体/周期体(anaphase promoting complex，cyclosome，APC/C)是参与细胞周期调控的两种主要的泛素连接酶E3复合物，分别在细胞周期的不同时相活化而发挥作用，从G1期一直延续到S期末，SCF显示活性，从M期的中期到G1/S期过渡，APC/C发挥重要作用[1，2]。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein2，SKP2)是SCF(Skpl-Cullin-SKP2)复合物的一种F-box蛋白，为SCF型泛素连接酶的靶蛋白识别组分，以细胞周期依赖的形式在G1晚期开始出现，S/G2期高表达，M期迅速下降，通过对CKI的泛素化降解而促进细胞周期G1/S期转换及S期的发展。许多研究表明，SKP2在多种人恶性肿瘤中表达增高，与多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、肺癌等的发生、发展及预后密切相关，被视为癌蛋白[3，4]，可作为研究抗肿瘤药物的新靶点。CDC20同源蛋白1(CDC20 homolog1，CDH1)是APC/C的激活因子之一，在有丝分裂后期和G1期，去磷酸化的CDH1与APC/C结合形成具有活性的APC/CCDH1复合物，泛索化降解Cdc20，Prc1，Tome-1，Plk1和Orcl，Cdc6，Geminin等推动细胞退出有丝分裂期进入G0/G1期[5]。
PI3K/Akt信号通路是细胞中调控细胞生长增殖的极为重要的途径，该通路的过度激活将导致肿瘤发生。研究表明，P13K/Akt通路可通过多种分子机制调控S期激酶相关蛋白-2(SKP2)蛋白的表达[6]。本课题组前期实验结果表明肺癌细胞中PI3K/Akt信号通路参与SKP2蛋白的表达调控，从而影响p27kipl蛋白的降解[7]，但其确切的分子机制尚不清楚。许多实验表明，CDH1可以靶向降解SKP2，使细胞处于G1期，防止未成熟的细胞过早的进入S期。但CDH1是否在PI3K/Akt对SKP2的调节中发挥作用并且其调节机制如何还不甚明了。LY294002是PI3K/Akt通路的特异抑制剂，IGF-1能在体外激活PI3K/Akt信号通路。本实验选取NSCLC系A549、LK2和H460为研究对象，观察IGF-1和LY294002对CDH1蛋白表达及细胞定位的影响，探讨NSCLC细胞中是否存在PI3K/Akt-CDHl-SKP2信号转导轴，及其可能存在的调控机制。
方法：
1、细胞培养，LK2、A549细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液、H460细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，饱和湿度、37℃，5％CO2孵箱中传代培养。
2、细胞分组，将生长至70％汇合度的细胞分组，处理组1加入PI3K/Akt激活因子IGF-1，处理组2加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002，对照组加入等体积的DMSO，作用24h后收集细胞。
3、应用噻唑蓝(MTT)比色实验检测LY294002、IGF-1对细胞的生长和增殖情况，并绘制生长曲线，筛选LY294002、IGF-1的最佳作用时间和作用浓度。
4、应用流式细胞术检测A549、LK2及H460三种细胞中对照组及处理组细胞周期变化。
5、应用Western-blot法检测肺正常细胞与肺肿瘤细胞A549、LK2及H460三种细胞中CDH1蛋白表达的差异及加入处理因素IGF-1、LY294002后p-Akt、SKP2、CDH1蛋白的表达变化。
6、应用免疫荧光法分析CDH1在A549、LK2及H460三种细胞中对照组及实验组定位变化。
7、应用核质分离方法检测A549、LK2及H460三种细胞中对照组及实验组胞核和胞质中CDH1蛋白的表达变化。
结果：
1、CDH1、SKP2在肺正常细胞与肺肿瘤细胞中蛋白的表达
CDH1蛋白在NSCLCA549、LK2、H460中表达明显低于在肺正常细胞HBE中的表达，而SKP2蛋白在NSCLCA549、LK2、H460中表达明显高于在肺正常细胞HBE中表达，提示CDH1可以作为一个肿瘤抑制因子调控SKP2蛋白的表达。
2、MTT法检测细胞增殖变化
0.1、1、10、100ng/mL等浓度IGF-1均促进NSCLCA549、LK2和H460细胞增殖，其中，1ng/mLIGF-1作用后细胞增殖率达到峰值(A549:20.21±1.31％;LK2:10±0.95％;H460:21.05±1.93％)，10、100ng/mL时细胞增殖率下降。
3、流式细胞术检测细胞周期进程
加入IGF-1后，与对照组相比，NSCLCA549、LK2、H460三种处理组细胞S期细胞均明显增加，而G1期细胞则较对照组减少，差异有统计学意义，表明IGF-1促进细胞G1/S期进程。
加入LY294002后，与对照组相比，NSCLCA549、LK2、H460三种处理组细胞S期细胞较对照组减少，而G1期细胞则较对照组明显增加，差异均有统计学意义，表明LY294002使细胞阻滞于G1期。
4、Western-blot法检测p-Akt、CDH1、SKP2蛋白的表达
与对照组相比，处理组1的三组细胞中p-Akt与SKP2蛋白表达量均增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。但CDH1蛋白无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)：处理组2的三种细胞中p-Akt与SKP2蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。CDH1蛋白无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。
5、免疫荧光法检测SKP2亚细胞定位
三组NSCLC细胞中对照组CDH1蛋白在细胞核和细胞质中都有表达，LY294002作用后，CDH1向细胞核内转移，在细胞核内的蓄积增多，细胞质中的部分减少。
6、核质分离检测CDH1在胞核和胞质中蛋白表达的变化
加入LY294002后，分别提取胞核蛋白、胞质蛋白，与对照组相比，Western Blot结果分析，三组NSCLC细胞中CDH1蛋白在细胞核中的表达增加，细胞质中表达减少。
结论：
1、NSCLC细胞中存在PI3K/Akt-CDH1-SKP2信号转导轴。
2、在NSCLC中PI3K/Akt信号通路可通过影响CDH1蛋白亚细胞定位，参与其对SKP2蛋白表达的调控作用。