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嵌合体是由不同遗传组成的细胞或者组织构成的嵌合生物个体。通过电融合制作小鼠四倍体胚胎与二倍体胚胎或者ES细胞嵌合后,四倍体胚胎来源的细胞贡献到胚外谱系中,二倍体细胞可以贡献到胚内和胚外谱系中,胚胎发育到期后能够得到完全来自二倍体胚胎或者ES的个体,这种方法称为四倍体补偿技术。因此,四倍体补偿技术可以绕过传统二倍体嵌合小鼠阶段,直接得到基因修饰的小鼠。除此之外,嵌合体的研究有助于胚胎细胞发育分化的研究和特殊物种基因保存,在动物育种、生产转基因动物研究、医学、产业化应用等众多领域也都具有广泛应用价值。
但关于猪嵌合体的研究鲜有报道,如何优化猪四倍体胚胎的制作方法,二倍体胚胎与四倍体胚胎嵌合最佳时期的确定,以及嵌合后不同倍性来源的细胞在嵌合囊胚中时如何分布等,都没有相关的报道,有待于研究。因此,为了探索猪的四倍体制作方法,四倍体嵌合体的制作方法,探索四倍体嵌合的生物学现象的观察,为建立与猪相关的疾病模型和转基因动物制作方法等奠定基础,本研究进行猪四倍体和四倍体嵌合的相关研究。
1制作猪四倍体胚胎体系的优化制作猪四倍体胚胎的最佳条件是90V,其融合率(82.33±6.13)、囊胚率(28.38±2.41)、胚胎死亡率(13.24±4.43)。
2.猪四倍体胚胎的发育时程和囊胚质量检测观察胚胎发育时程,发现四倍体在发育早期稍晚于二倍体胚胎,但是发生致密化和囊胚形成时间相近,并且四倍体与二倍体的发育率接近无显著差异,但4N囊胚细胞数(21.90±4.95)与2N囊胚细胞数(45.34±5.00)差异显著。
3.荧光原位杂交技术(FISH)检测四倍体的倍性用荧光原位杂交技术检测了胚胎的倍性,检测融合后胚胎发育到囊胚时融合后发育的囊胚中68.18%为四倍体,27.27%为二倍体,4.5%为2N/4N嵌合胚胎。对照组二倍体囊胚中95%为二倍体,5%为2N/4N嵌合胚胎。
4.2N-4N胚胎嵌合最佳聚合时期的探索4-Cell(4 N)<->4-Cell(2 N)聚合方式的囊胚率(74.36%)、囊胚细胞数(67.10±15.39)显著高于其它试验组。
5.2N-4N嵌合胚胎中不同倍性细胞分布特征4-Cell(4 N)<->4-Cell(2 N)聚合20对,获得12个囊胚,其中10个囊胚中2N胚胎细胞主要分布于ICM位置,少量分布于TE位置;另外2个囊胚中没有出现任何的GFP信号,应该是没有嵌合成功。反试验组中,聚合10对,发育得到5个囊胚,发现ICM外层和大部分的TE部位为4N胚胎来源细胞。
6.四倍体胚胎与IPS细胞嵌合的研究夹心聚合法进行嵌合时,IPS细胞团与4N胚胎进行嵌合成功,囊胚率为62.5%,囊胚中IPS嵌合率为45%。显微注射法制作嵌合胚胎,注射的IPS细胞成功嵌合到2N和4N囊胚中,2N囊胚中IPS嵌合率为21.54%,4N囊胚中IPS嵌合率为29.79%。
综上所述,本研究获得了猪四倍体制作优化体系,探索了四倍体与二倍体胚胎的嵌合和四倍体胚胎与IPS细胞的嵌合情况,为猪的四倍体胚胎和四倍体胚胎嵌合奠定了一定的基础。