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研究背景和目的:骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种常见的慢性退行性病变,关节滑膜炎和软骨下重建是其主要特征。当今社会,伴随着肥胖和老年化问题的日益严重,该病的发病率也在不断提高。如今,如何防治骨性关节炎,有效地保护软骨细胞和组织,抑制甚至逆转软骨退变,已成为骨科研究的重点和热点。软骨细胞作为关节软骨组织中的唯一细胞,在调节软骨细胞外基质(ECM)的分泌和代谢中起重要作用。已有一些研究报道表明,促进软骨细胞增殖并抑制其凋亡是防治骨性关节炎的重要一环。TRPV6是瞬时性受体电位(transientreceptor potential,TRP)超家族中的成员,作为一种具有高度选择性的钙离子通道蛋白,其可能通过调节细胞内钙离子浓度,影响细胞增殖分化和凋亡。本次研究的目的是初步在细胞水平上,研究TRPV6对大鼠关节软骨细胞分泌细胞外基质、增殖、凋亡的影响及其机制,为关节软骨退变的发病机制提供理论补充,为防治该类疾病提供新思路。实验方法:1.取八周雄性大鼠,联合酶(胰蛋白酶、II型胶原蛋白酶)消化法分离关节软骨细胞并培养,采用阿利新蓝染色法鉴定。2.采用TRPV6-shRNA慢病毒表达载体和TRPV6过表达慢病毒载体体外感染大鼠关节软骨细胞,通过Westen Blot实验检测各组细胞TRPV6蛋白的表达量,验证干扰效果。本部分实验分为5组:对照组、Lenti-shRNA-TRPV6组(干扰组)、Con Lenti-shRNA组、Lenti-shRNA-TRPV6+Lenti-TRPV6组(补救组)、Con Lenti-Activation组。3.阿利新蓝染色后比较对照组、干扰组、补救组软骨细胞的蛋白聚糖含量,并通过Westen Blot实验比较各组中COL-2和COL-1的表达水平高低。4.利用CCK-8检测法、CFSE标记下流式细胞术和EdU标记法检测并比较对照组、干扰组、补救组软骨细胞的增殖能力。5.通过Annexin V-PI双染色法,caspase-3活性测定,及BCL-2和Bax蛋白的表达变化,观察并比较对照组、干扰组、补救组软骨细胞的凋亡情况。实验结果:1.分离培养24小时后的原代大鼠关节软骨细胞,在倒置显微镜下观察,形态呈多角形,椭圆形核仁位于包体中心,培养96小时可见细胞成簇现象。阿利新蓝染色后见细胞胞核成深蓝色,胞质和包膜成淡蓝色。2.细胞转染干扰效果的实验验证中,干扰组TRPV6蛋白表达量明显低于对照组,补救组TRPV6蛋白表达量较干扰组稍有提高,差异有统计学意义(P<0.01);Con Lenti-shRNA组和Con Lenti-Activation组TRPV6蛋白表达水平与对照组相比无明显差异。3.阿利新蓝染色后,酶标仪在波长600纳米处检测各组细胞吸光度值,干扰组较对照组明显降低,补救组稍高于干扰组,差异存在统计学意义(P<0.05);Western Bolt检测结果提示,三组细胞COL-2蛋白表达量存在差异(干扰组<补救组<对照组),三组细胞COL-1蛋白表达量同样存在差异,但趋势与COL-2蛋白相反(干扰组>补救组>对照组),差异有统计学意义(P<0.01)。4.CCK-8法,CFSE标记法,EdU标记法检测结果一致证实,干扰组软骨细胞增殖能力明显弱于对照组,补救组软骨细胞增殖能力介于干扰组和对照组之间。5.Annexin V-PI双染色法检测结果提示,干扰组细胞凋亡数量明显高于对照组,补救组细胞凋亡数量较干扰组稍降低,差异有统计学意义(P<0.05);Caspase-3蛋白酶活力检测结果提示,干扰组caspase-3蛋白酶活力明显高于对照组,补救组caspase-3蛋白酶活力稍低于干扰组,差异存在统计学意义(P<0.01);Western Bolt检测结果提示,干扰组BCL-2蛋白表达量低于对照组,但Bax蛋白表达量高于对照组,补救组BCL-2、Bax蛋白表达量均介于对照组和干扰组之间,三组间BCL-2/Bax比值差异有统计学意义(P<0.01)。结论:TRPV6可促进大鼠关节软骨细胞分泌细胞外基质,促进大鼠关节软骨细胞的增殖分化,并抑制其凋亡。因此,TRPV6可能在保护关节软骨细胞功能,防治骨性关节炎中起着重要作用。