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肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor, HGF) 即扩散因子 (scatter factor, SF) 是目前所发现的活性最强的刺激肝细胞再生的细胞因子，曾被误认为是肝细胞特异性生长因子，后来发现它对肾小管、肺泡、胃肠道粘膜上皮等许多上皮细胞均具有促有丝分裂、诱导形态发生的作用。HGF对癌细胞具有促分裂、诱导肿瘤细胞迁移、侵袭以及诱发肿瘤血管生成的作用。HGF/SF的作用通过c-Met介导，这是一种原癌基因, 属跨膜蛋白。c-Met在多种组织和细胞中都有表达。已知它在肝细胞、脾、肾、造血细胞、肝细胞瘤、胃癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌等组织中都可以表达。在正常组织中，c-Met的mRNA浓度很低甚或检测不到，但其对应的癌组织则有很高的表达。因此，抑制HGF与c-Met的相互作用是抑制肿瘤产生、诱导肿瘤细胞凋亡的一个很有前途的策略。许多学者尝试利用反义寡核苷酸、核酶等方式抑制c-Met的表达，但都具有转导效率低，作用时间短暂等缺点。RNA干扰 (RNA interference, RNAi ) 技术的出现为我们抑制基因表达提供了一种新的思路。它是1998年由Fire等人提出的，是一种使特定基因沉默、使其功能丧失或降低，具有高度序列专一性的RNA诱导的转录后调控方式。它以其独具的特异性、<WP=111>持续性和敏感性，在基因组药物、基因治疗、基因功能研究、基因表达调控机制研究等方面得到越来越广泛的应用。本实验通过病毒载体介导的RNA干扰技术抑制HGF受体c-Met的表达，以达到抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的目的，为肿瘤基因治疗奠定基础并开拓新思路。首先，通过PCR方法获得人U6启动子及带有c-Met反向互补靶序列的片段HU6shmet，利用腺病毒载体及腺相关病毒载体将其传递至SK-BR-3细胞。然后，以未转导病毒的细胞作为基本对照，以GFP监测转导效率，以携带c-Met不相关shRNA的病毒载体转导的细胞为非特异性抑制对照，以β-actin为内参，通过RNA狭缝杂交检测其c-Met mRNA水平，通过Western Blot检测c-Met蛋白水平。最后，以MTT法检测SK-BR-3细胞增殖能力。本实验获得的带有人U6启动子及c-Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2滴度分别为108.25 TCID50/ml和108 TCID50/ml；带有人U6启动子及c-Met反向互补靶序列的重组腺相关病毒载体rAAVUshmet1和rAAVUshmet2病毒滴度均为4×1012vg/ml。结果表明，SK-BR-3细胞c-Met的表达量高于HepG2和QGY7703细胞。rAd转导SK-BR-3细胞的效率达100%，rAAV的转导SK-BR-3细胞的效率为20%。与rAdUsicon相比，rAdUshmet1转导的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA相对表达量下降了35.0% (p<0.005)，rAdUshmet2转导的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA相对表达量下降了48.7% (p<0.005)。与未转导病毒的细胞相比，rAdUshmet1转导的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA相对表达量下降了30.7% (p<0.05)，rAdUshmet2转导的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA相对表达量下降了45.3% (p<0.005)。与rAAVUsicon相比，rAAVUshmet1转导的SK-BR-3细胞的c-Met <WP=112>mRNA相对表达量下降了6.4% (p<0.05)，rAAVUshmet2转导的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA相对表达量下降了7.0% (p>0.05)。与未转导病毒的细胞相比，rAAVUshmet1转导的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA相对表达量下降了8.5% (p<0.05)，rAAVUshmet2转导的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA相对表达量下降了9.1% (p<0.05)。与rAdUsicon相比，rAdUshmet1转导的SK-BR-3细胞的c-Met 蛋白相对表达量下降了9.7% (p<0.05)，rAdUshmet2转导的SK-BR-3细胞的c-Met 蛋白相对表达量下降了32.0% (p<0.005)。与未转导病毒的细胞相比，rAdUshmet1转导的SK-BR-3细胞的c-Met 蛋白相对表达量下降了24.2% (p<0.005)，rAdUshmet2转导的SK-BR-3细胞的c-Met 蛋白相对表达量下降了42.9% (p<0.005)。与未转导病毒的细胞相比，rAdUshmet1对SK-BR-3细胞增殖抑制率在24h、48h、72h分别为29.4%、61.1%、77.2%，rAdUshmet2分别为37.2%、63.7%、83.5%；与rAdUsicon相比，rAdUshmet1对SK-BR-3细胞增殖抑制率在24h、48h、72h分别为24.1%、41.5%、53.8%，rAdUshmet2为32.4%、45.4%、66.7%。本实验得出以下结论：RNA干扰是抑制基因表达的有效策略；腺病毒载体可以高效地转导SK-BR-3细胞，是进行乳腺癌基因治疗的有效载体；SK-BR-3细胞是c-Met的阳性高表达细胞株；SK-BR-3细胞对腺相关病毒载体不敏感；抑制HGF受体c-Met的表达是抑制乳腺癌细胞增殖的有效途径；利用腺病毒载体介导的针对c-Met的短发夹结构RNA可以有效地抑制乳腺癌细胞中c-Met的表达，阻断HGF-c-Met信号传导通路，并进而抑制乳腺癌细胞的增殖。本实验的创新点在于：首次采用RNAi技术，通过体内转录短发夹RNA结构的方式对HGF受体c-Met的表达进行研究；首次通过腺病毒载体和腺相关病毒载体介导对SK-BR-3细胞受体进行研究；首次发现针对<WP=113>c-Met的短发夹RNA可以有效地抑制乳腺癌细胞中c-Met的表达，并进而抑制乳腺癌细胞的增殖。综上所述，下一步的工作期望通过对腺病毒载体改造，进一步提高腺病毒载体的作用时效；通过多基因联合应用RNAi策略，进一步对HGF-c-Met信号传导通路及其它肿瘤相关基因进行研究，最终开发出特异高效?