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研究目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的健康。目前,针对乳腺癌的治疗方法主要包括手术治疗、放射治疗、化疗、内分泌治疗以及生物免疫治疗等手段。大量的研究表明,恰当的免疫治疗联合化疗能够实现更佳的抗肿瘤效果并提高患者的预期寿命。本文设计并制备了一种同时携载免疫激动剂瑞喹莫德(Resiquimod,R848)和低剂量的化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)的纳米体系,以期实现免疫治疗联合化疗治疗乳腺癌。研究方法第一部分材料的制备及表征:1)聚组氨酸(Polyhistidine,PHIS)-R848纳米胶束的制备:聚组氨酸通过亲疏水相互作用物理包埋R848制备得PHIS-R848纳米胶束;2)合成阿霉素透明质酸高分子前药HA-DOX:将透明质酸(Hyaluronic acid,HA)通过p H敏感基团连接细胞毒类药物阿霉素,首先利用EDC作为交联剂,HA通过酰胺键共价连接丁二酰肼,然后通过丁二酰肼末端的氨基与阿霉素的羰基之间的席夫碱反应生成具有p H敏感的腙键,合成阿霉素透明质酸高分子前药HA-DOX;3)利用HA-DOX和PHIS-R848之间的正负电荷相互作用,将HA-DOX包裹PHIS-R848纳米胶束,制备同时携载R848和DOX的纳米体系(HA-DOX-PHIS-R848);4)采用透射电子显微镜(TEM)、动态激光粒度分析仪、Zeta电位测定仪测定纳米粒的形貌、粒径和表面电荷性质,利用紫外可见分光光度法(UV)测定HA-DOX载药能力。第二部分体外实验:1)PHIS-R848处理CAL-1细胞(人p DC-like细胞)后,利用实时定量PCR(Real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测IFN-α、IL-6、IL-12p40以及TNF-αm RNA表达;2)通过流式细胞仪检测人乳腺癌MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞以及小鼠乳腺癌4T1细胞表面CD44分子的表达情况;3)通过动态透析法考察不同p H值条件下阿霉素透明质酸高分子前药HA-DOX的体外释药特性;4)利用激光共聚焦显微镜考察MCF-7细胞对HA-DOX的摄取及细胞内的释放情况;5)采用CCK-8试剂盒检测HA-DOX-PHIS-R848分别对人乳腺癌MCF-7细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞的毒性作用;6)通过免疫印迹法检测HA-DOX-PHIS-R848对人乳腺癌MCF-7细胞中Caspase-9、Caspase-3蛋白表达的影响。第三部分动物体内实验:1)构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型;2)采用荧光染料Cy5.5对PHIS-R848和HA-DOX-PHIS-R848进行荧光标记,制备荧光标记的PHIS-R848-Cy5.5和HA-DOX-PHIS-R848-Cy5.5;3)通过小动物活体成像技术考察PHIS-R848-Cy5.5和HA-DOX-PHIS-R848-Cy-5.5在荷瘤裸鼠体内的组织分布情况,评价其对乳腺癌的靶向作用;4)尾静脉注射给药后,评价HA-DOX-PHIS-R848对乳腺癌的联合治疗作用。结果第一部分:成功将R848包埋于聚组氨酸,透射电镜结果显示其为较均匀的球形,分散性良好,动态激光粒度分析仪测得粒径大小为153.1±5.6 nm,粒径分散性指数PDI值为0.132,Zeta电位为40.4±0.7 m V;成功合成了阿霉素透明质酸高分子前药(HA-DOX),测得其载药量约为5%;成功将HA-DOX包裹于PHIS-R848表面,形成了具有典型核壳结构的纳米共载体系HA-DOX-PHIS-R848,HA-DOX-PHIS-R848的粒径大小为213.4±8.4 nm,粒径分散性指数PDI值为0.248,Zeta电位为-34.5±0.5 m V。第二部分:PHIS-R848可激活CAL-1细胞,引起细胞因子IFN-α、IL-6、IL-12p40以及TNF-αm RNA表达升高;人乳腺癌MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞以及小鼠乳腺癌4T1细胞表面高表达CD44分子;阿霉素透明质酸高分子前药HA-DOX的体外释药具有显著的p H敏感特性,在释放介质p H值为7.4时,其释药较为缓慢,在p H值为5.5时,释药量明显增加;激光共聚焦显微镜显示HA-DOX处理细胞24 h后,DOX完全蓄积于细胞核;HA-DOX-PHIS-R848可以激活Caspase-9和Caspase-3的表达,诱导细胞凋亡,CCK-8实验结果显示其能有效地抑制乳腺癌细胞的生长。第三部分:成功构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型,经尾静脉注射PHIS-R848-Cy5.5和HA-DOX-PHIS-R848-Cy5.5,24 h后,纳米共载体系主要分布于荷瘤裸鼠的肿瘤组织,显示出其良好的体内乳腺癌靶向作用;动物体内抑瘤实验结果表明HA-DOX-PHIS-R848具有协同抑制肿瘤生长的作用。结论本研究设计并成功构建了一种新型的靶向乳腺癌的纳米体系,该纳米体系同时携载了化疗药物DOX和免疫激动剂R848,实现了两种药物的靶向投递和对乳腺癌的协同治疗,为临床乳腺癌治疗提供了新的策略。