人类ERMAP基因在胎儿造血过程中的作用的初步研究

来源 :广州医学院 广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhoulijun
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研究背景: 人类胚胎期造血经历了卵黄囊造血、肝脾造血和骨髓造血等三个阶段,与此同时,造血细胞也经历了产生、迁移、增殖、分化、成熟和释放的动力学过程。在上述过程中,各器官的造血活动是连续不断、此消彼长的。然而,造血器官的造血活动是如何从形成到旺盛,而后逐渐衰退的?期间的调控机理如何?至今尚未阐明。越来越多的研究表明,某一器官的造血能力主要取决于其造血微环境,在胚胎发育过程中,当一个器官的造血微环境不再适合造血活动时,其中的造血干细胞便随血液流向其它组织,寻找新的、更适宜的造血微环境,并定植于其中,与其中的成分相互作用,从而启动造血细胞的增殖与分化,最后形成新的造血中心。 造血细胞的迁移和定植是由造血细胞表面的一系列粘附分子与造血微环境中相应的配体结合后所引起的信号转导的结果,这种粘附分子与相应配体的相互作用,在造血细胞的增殖和分化过程中同样发挥着重要的调节作用。造血微环境中的粘附分子及其配体,与细胞外基质、细胞因子、转录因子等共同形成造血调控网络的分子基础。 因此,研究胚胎期不同阶段红细胞基因表达谱,不断发现新的影响胚胎期红系造血的调控因子并加深对红细胞增殖与分化调控的分子机制的认识,对揭示胚胎期红细胞生成的规律,揭示胚胎期或生后某些红细胞疾病的发病机理,寻找有效的干预措施,具有积极的意义。 2000年,Ye等从鼠胚胎红细胞cDNA文库中筛选出ERMAP基因,2001年,Su等又从人胎肝cDNA文库中筛选出人类ERMAP基因,与此同时,Xu等也从妊娠第10周及22周胎肝消减cDNA文库中筛选出人类ERMAP基因。通过NorthernBlot显示其高度特异表达于胎肝及成人骨髓等造血组织以及K562和HEL细胞株,通过荧光蛋白转染试验证实其定位于293T细胞膜和其他胞浆小体上,通过荧光原位杂交显示其可表达于第12周和23周的胎肝红细胞、成人骨髓,以及第8~12周脐带血中的网织红细胞和原始红细胞膜,通过对其所编码的蛋白分子的分析显示其为一跨膜蛋白分子,属免疫球蛋白超家族成员。推测其可能通过细胞间的粘附和/或识别,影响红系造血,或在红系相关性疾病、自身免疫性疾病和其他疾病中起一定作用。然而,目前关于该基因的特性、功能、在造血过程中的作用及其与红系相关性疾病和其他疾病的关系等等,尚待进一步研究。 研究目的: 1.通过探讨不同组织匀浆制备方法、不同引产方式、不同引产药物等因素对胎儿组织完整RNA抽提质量的影响,摸索胎儿器官组织完整RNA抽提的方法,为制备完整、高纯度的RNA,以进一步采用FQ-PCR、NorthernBlot等方法研究人类ERMAP基因在胎儿期造血过程中的作用奠定基础。 2.通过观察人类ERMAP基因在不同胎龄胎儿肝脏、骨髓、脾脏、肾脏、胸腺、心脏、肺脏、大脑及肌肉等9个脏器组织中的表达谱及表达量的变化,探讨人类ERMAP基因在胎儿造血过程中的作用。 研究内容: 1.人类胎儿组织完整RNA抽提方法的摸索。 2.人类ERMAP基因在不同胎龄、不同胎儿器官组织中的表达谱和表达量的变化。 研究方法: 1.人类胎儿组织完整RNA抽提方法的研究以完整RNA抽提阳性率、RNA纯度等作为评价RNA质量的指标,比较液氮研磨及匀浆器两种制备组织匀浆的方法,以及不同引产方式(药物引产组和非药物引产组)、不同引产药物(利凡诺组和米非司酮组)对胎儿组织RNA抽提质量的影响。 2.人类ERMAP基因在胎儿发育过程中的表达①NorthernBlot:选取一个25+5W难免流产胎儿,取其肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑、骨髓和肌肉等9种脏器组织,抽提RNA作为模板,以PCR方法标记探针,进行NorthernBlot,检测人类ERMAP基因在胎儿脏器组织中的表达谱;②FQ-PCR:每3~4周胎龄为一组,将胎儿分为9~11W、12~14W、15~17W、18~20W、21~23W、24~26W、27~29W、30~32W和33~36W,共9组,每组3~4个标本,取其肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑、骨髓和肌肉等9种脏器组织,抽提RNA作为模板,以FQ-PCR方法检测人类ERMAP基因在胎儿发育过程中表达量的变化。 研究结果: 1.药物引产组和非药物引产组抽提胎儿组织的完整RNA阳性率、RNA纯度无显著差异(p分别为0.750和0.200);利凡诺组和米非司酮组抽提胎儿组织的完整RNA阳性率、RNA纯度无显著差异(p分别为0.100和0.390);液氮研磨组抽提胎儿组织的完整RNA阳性率高于匀浆器处理组(p=0.000),两组的RNA纯度无显著性差异(p=0.167)。 2.NorthernBlot显示:人类ERMAP基因在25+5周胎儿肝脏和骨髓表达阳性,其长度约为3.6kb,而脾脏、肾脏、胸腺、心脏、肺脏、大脑及肌肉等表达阴性。3.FQ-PCR显示:①人类ERMAP基因在9~36周胎儿肝脏中均有表达,其表达量从第12周开始升高,18~20周达高峰,21周后开始下降并稳定于较低水平;②人类ERMAP基因在9~14周胎儿骨髓中不表达,从15周开始表达,27~32周达高峰,之后迅速下降;③检测脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑及肌肉7种脏器各17个标本,结果显示ERMAP基因仅在部分标本中低水平表达,其表达的阳性率(即各脏器阳性例数与总例数之比)分别为20%、7.6%、25%、13%、20%、7.6%和25%。 结论: 1.在胎儿组织RNA抽提时,采用液氮研磨法进行组织匀浆,获得完整RNA的阳性率较匀浆器处理法高;引产方式、引产药物对胎儿组织RNA抽提质量无直接影响。 2.人类ERMAP基因表达于妊娠25+5周胎肝及骨髓组织,其长度约为3.6kb,而在心脏、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺、大脑及肌肉等器官组织表达阴性。 3.人类ERMAP基因在妊娠9~36周胎儿肝脏中均有表达,其表达量从第12周开始上升,18~20周达高峰,2l周后开始下降并维持低水平表达。 4.人类ERMAP基因在妊娠9~14周胎儿骨髓中不表达,从15周开始表达,27~32周达高峰,32周后表达迅速下降。 上述结果提示:①人类ERMAP基因的功能可能与胎儿发育过程中,红系细胞向肝脏和骨髓的迁移活动有关;②人类ERMAP基因对红系造血细胞的增殖和分化无直接的正性调控作用,或者仅作为辅助因子,参与红系细胞的增殖和分化。但这一推论有待下一步的实验研究予以证实。 人类ERMAP基因是如何通过与配体的相互作用而产生信号转导的?其转导通路是什么?如何通过与其他粘附分子、转录因子和细胞因子的相互作用而实现胚胎造血调控?其在红系造血的生理和病理过程中有何意义?等等,尚待更深入的研究。
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