论文部分内容阅读
骨肉瘤(osteosarcoma)是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤,是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤。骨肉瘤由于恶性程度高,侵袭性强,较早出现肺部转移,因而骨肉瘤患者的预后非常差。近年来随着辅助化疗和新辅助化疗的应用,患者的生存率得到明显的改善,保肢手术逐步取代截肢手术。然而对于某些特殊的骨肉瘤患者,如肿瘤生长在脊柱、颅底、骨盆等特殊部位以及术后复发或多处转移的晚期病人,手术往往难以进行而只能进行姑息性治疗,但仅仅通过大剂量的化疗,往往在带来显著的副作用的同时临床疗效却不尽如人意。因此对于骨肉瘤这类放疗不敏感的肿瘤类型,如果能够找到一条放射增敏的途径,充分利用放射治疗的优势,将在一定程度上改善骨肉瘤患者的治疗现状。放射增敏研究是肿瘤学研究的一个热点,对于改善临床放射治疗的疗效具有重要意义。研究发现,肿瘤的放射敏感性与细胞DNA损伤的自我修复能力有关,由共济失调-毛细血管扩张突变(Ataxia Telangiectasia Mutated, ATM)蛋白介导的DNA损伤的自我修复过程是近年来的研究热点。研究同时发现,某些药物能通过使ATM表达下降而达到放射增敏的作用。本课题以人骨肉瘤U-2OS细胞为研究模型,姜黄素为研究对象,较为系统地研究了姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞的放射增敏作用,并以ATM参与的细胞DNA损伤自我修复能力作为切入点,深入探讨了姜黄素放射增敏的分子机制及其信号转导通路。第一部分姜黄素与x射线联合应用对人骨肉瘤细胞增殖及细胞周期的影响目的通过观察姜黄素联合X射线对人骨肉瘤U-20S细胞增殖及细胞周期的影响,了解姜黄素对人骨肉瘤U-20S细胞是否具有放射增敏作用。方法选取人骨肉瘤U-20S细胞作为研究对象,将细胞分为对照组、单独姜黄素处理组、单独放射处理组、姜黄素与放射联合处理组。分别应用MTT实验和平板集落形成实验检测姜黄素与x射线联合应用对细胞增殖活性的影响；应用流式细胞仪检测姜黄素与X射线联合应用对细胞周期及细胞凋亡的影响。结果MTT实验检测发现姜黄素与X射线联合处理能显著提高人骨肉瘤U-20S细胞增殖抑制率,且姜黄素浓度越大抑制作用越强,作用时间越长抑制作用越强。细胞克隆形成实验发现姜黄素与X射线联合作用下细胞存活分数明显低于对照组。流式细胞仪检测发现姜黄素与X射线联合作用引起细胞S期阻滞。结论姜黄素对人骨肉瘤U-20S细胞增殖有抑制作用,而且随着姜黄素浓度的增大,作用时间的增长,抑制作用增强。姜黄素能够作为一种有效的放射增敏药物提高人骨肉瘤U-20S细胞的放射敏感性,其机制可能与细胞的S期阻滞有关。第二部分抑制ATM的表达对人骨肉瘤细胞放射敏感性的影响目的探讨姜黄素是否能通过靶向抑制人骨肉瘤U-20S细胞ATM基因的表达,从而影响放射处理后人骨肉瘤细胞DNA损伤的自我修复能力。方法利用Real-time PCR和Western Blot技术检测IRNA干涉后ATM的表达。将细胞分为NCsiRNA处理组、NCsiRNA联合放射组、ATMsiRNA组和ATMsiRNA联合放射组。利用细胞克隆形成实验和流式细胞仪分别检测x射线对细胞增殖和细胞周期的影响。并利用Real-time PCR和Western Blot技术探讨姜黄素与人骨肉瘤细胞ATM表达的关系。结果ATMsiRNA转染人骨肉瘤U-20S细胞后,利用Real-time PCR和Western Blot技术检测发现ATM表达下降。细胞克隆形成实验发现ATMsiRNA与x射线联合作用下细胞存活分数明显低于对照组。流式细胞仪检测发现ATMsiRNA与x射线联合作用能引起细胞S期阻滞。利用Real-time PCR和Western Blot技术检测发现姜黄素处理人骨肉瘤U-20S细胞,其ATM表达下降。结论在ATM基因沉默后,人骨肉瘤U-20S细胞的放射敏感性增加；并且姜黄素能够抑制ATM的表达。第三部分抑制NF--kB的活性影响姜黄素对ATM表达的调控目的探讨姜黄素是否能通过抑制NF-KB的活性影响人骨肉瘤U-20S细胞的ATM的表达,从而影响放射处理后人骨肉瘤细胞DNA损伤的自我修复能力。方法利用Real-time PCR和Western Blot技术检测RNA干涉后的NF-κB的表达。将细胞分为NCsiRNA处理组、NF-κBsiRNA组、NCsiRNA联合姜黄素组和NF-KBsiRNA联合姜黄素组。利用Real-time PCR和、Vestern Blot技术检测NF-κBsiRNA转染后姜黄素对X射线对人骨肉瘤U-20S细胞ATM表达的影响。结果NF-κBsiRNA转染人骨肉瘤U-20S细胞后,利用Real-time PCR和Western Blot技术检测NF-KB表达下降。利用Real-time PCR和Western Blot技术检测发现姜黄素处理人骨肉瘤U-2OS细胞ATM表达下降,NF-κBsiRNA联合姜黄素组ATM表达下降不明显。结论姜黄素所导致的人骨肉瘤U-20S细胞中ATM表达的下降可能是通过NF-κB信号转导通路完成的。