长白落叶松木质素关键基因核苷酸多态性检测及关联分析

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长白落叶松(Larix olgensis)是温带和寒温带重要的纸浆用材树种,具有生长快、适应性强、经济价值高等优点。木质素约占木材干重的15%~36%,在植物体中起机械支持、水分运输及病虫害防御等重要作用,但在造纸业中,它是形成造纸污染的主要原因。利用基因工程手段,在分子水平调节木质素的生物合成,降低木质素的含量或改变其组分,培育出更利于制浆工业脱木质素的植株,对于降低造纸成本和环境保护将具有重要意义。本研究以10个种源的长白落叶松单株为研究对象,通过对与木质素相关的4个重要基因的单核苷酸多态性分析,筛选出与木材材性和生长性状关联显著的SNP位点,找到具有育种价值的功能SNP位点,为长白落叶松木材材性及生长性状分子标记辅助育种提供理论依据。主要研究结果如下:  1、4个木质素相关基因的生物信息学分析。已有研究证明4CL,CAD,SAM,TUBA基因是与木质素相关的重要基因,通过长白落叶松转录组测序,获得长白落叶松4CL,CAD,SAM,TUBA四条基因序列,利用同源序列法,克隆得到4CL基因2009bp基因组序列,含有1611bp的完整开放阅读框,可编码537个氨基酸残基的蛋白质。同源性分析和系统进化树均显示长白落叶松与花旗松亲缘关系较近。克隆得到CAD基因1675bp的基因组序列,含有1062bp的完整开放阅读框,可编码354个氨基酸残基的蛋白质。克隆得到SAM基因1387bp的基因组序列,含有747bp的完整开放阅读框,可编码249个氨基酸残基的蛋白质。克隆得到TUBA基因2574bp基因组序列,含有1353bp的完整开放阅读框,可编码含有451个氨基酸残基的蛋白质。  2、SNP的筛选与分析。4个基因中共检测到182个单核甘酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/42bp,多样性指数分析表明长白落叶松具有较高程度的核苷酸多样性(θW=0.00627,πT=0.00761),θW和πT在不同基因中的变化范围分别为0.0174~0.01278和0.00136~0.01577。SAM基因的核苷酸多样性最低,4CL基因的核苷酸多样性最高;非同义多样性(πnonsyn=0.00529)和平均沉默多样性(πsil=0.00639)水平均低于平均同义多样性(πsyn=0.00898),同义突变的核苷酸多样性是非同义突变核苷酸多样性的1.7倍,说明编码区在长白落叶松物种演化过程中受到纯化选择压力;单倍型多样性平均Hd值为0.792。中性检测结果显示TajimaD值在4个基因中的范围为-1.4371~3.8933,FuLiF*值的范围为-1.5614~1.5625,FuFs值的范围为-2.539~0.185。均出现负值,说明这些基因中存在很多低频率突变。LD分析显示4CL基因SNP间连锁程度较高,而CAD、TUBA和SAM基因SNP间连锁程度较低。  3、SNPs与生长性状及材性性状的关联分析。将突变频率大于10%的84个常见SNP位点,经单位点和单倍型分别与表型性状关联分析共筛选出13个与木质素含量、木材密度等性状显著关联的SNP位点,其中与木质素含量性状关联SNP3个(SNP14、SNP26、SNP51)、密度性状关联SNP3个(SNP7、SNP15、SNP47)、树高性状关联SNP3个(SNP41、SNP57、SNP65)、碳储量性状关联SNP6个(SNP10、SNP11、SNP24、SNP32、SNP41、SNP51)。其中与木质素含量极显著相关的2个重要SNP位点(SNP14、SNP26),其GG基因型和AA基因型,G-A半倍型以及GGAA合并基因型个体的生长量大,木质素含量低,这些功能SNP标记可作为长白落叶松木质素含量分子标记辅助育种的有效标记。
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