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酰基辅酶A结合蛋白（Acyl CoA binding protein,ACBP）是分子量约有10kD的保守性蛋白,普遍存在于真核生物中。该蛋白能够特异性的与中长链酰基辅酶A酯结合,并且在一定程度上调控着脂肪酸的β氧化,脂肪酸链的延长,以及鞘脂类的合成等脂类代谢。鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）主要应用于酱油后期发酵,其能够在含盐量高达18%的发酵缪中生长,并且使得酱油的风味更加醇厚,香浓。而风味物质中的大部分为酯类物质,因此,探索鲁氏酵母中的相关基因是否对风味物质有影响是具有一定的研究价值的。本课题主要是对鲁氏酵母脂肪酸代谢相关基因-酰基辅酶A结合蛋白（Zracbp）基因做了前期的功能结构研究,为后续的研究奠定了一定的基础。主要研究内容有:1.Zracbp基因的克隆:经过克隆分析,发现Zracbp基因在鲁氏酵母中只有一个拷贝;含有264bp编码序列,不含内含子;编码87个氨基酸,分子量约为10KD;分析ZrACBP氨基酸片段发现其与大多数物种的ACBP一样,不含有跨膜片段以及信号肽,是一个胞内蛋白;进化上,与酿酒酵母的同源性较高;从结构上分析预测,ZrACBP的不稳定系数>40,蛋白性质较为不稳定;其只含有一个较大的疏水性片段,脂溶性较高;其二级结构主要是以α螺旋为主,其次是无规则卷曲,这与大多数的ACBP蛋白结构相符。2.重组ZrACBP-MBP蛋白的表达,纯化以及功能的鉴定:构建原核过量表达pMAL-MBP-Zracbp载体,并且转入Rosetta DE3细胞进行重组蛋白的诱导表达,纯化以及重组蛋白与酰基辅酶A酯结合能力的测定。结果显示,克隆进入pMAL-c4X载体的Zracbp基因进行诱导之后能够大量的表达,可进行后续的纯化。将纯化定量的蛋白与九种酰基辅酶A酯进行MST结合检测,实验结果显示ZrACBP能够结合酰基辅酶A酯,尤其是中长链酰基辅酶A酯,其中最大结合能力的为C14:0酰基辅酶A酯;但是整体的结合能力比酿酒酵母小一个数量级,这就说明了可能ZrACBP结合酰基辅酶A的能力只是其功能的一小部分,可能更多的参与别的代谢。3.ZrACBP蛋白结构的解析:构建Pet-His-Zracbp载体,进行重组蛋白的诱导,表达,纯化,浓缩,并进行蛋白的结晶,衍射以及结构解析。解析结果显示:ZrACBP晶胞属于P21空间群,晶胞参数为a=36.90,b=30.85,c=37.93,α=90.0,β=99.93,γ=90.0。使用分子置换的方法在1.8?分辨率下解析出ZrACBP也是由四个螺旋柱构成基本骨架。四个螺旋柱分别由A1:Q4-A13,A2:T22-T37,A3:I47-E60,A4:K67-Q87构成,其中螺旋A1与A2,A3与A4由一段无规则卷曲连接,A2与A3之间不但有无规则卷曲,还有一段η结构连接。4.ZrACBP真核表达模式分析:在YPD培养基中添加18%的盐用来模拟酱油高盐发酵环境,发现鲁氏酵母生长周期变长,尤其是后续发酵时间延长;使用qRT-PCR方法测定Zracbp基因在不同生长时期的表达量,结果显示Zracbp的表达量与生长曲线变化有一定的相关性,并且,在后续发酵时间中,Zracbp的表达量升高,这可能与后续发酵香味物质的产生有关;在酵母中过量表达Zracbp基因经过转录组分析结果不显著,还需要进一步优化实验条件;此外,构建成功的尿嘧啶营养缺陷型鲁氏酵母菌株为后续的研究奠定了一定的基础。