【摘 要】
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植酸酶（myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase; EC3.1.3.8）能水解催化分解植酸生成无机磷酸和肌醇。植酸酶可分解植物来源饲料中的植酸生成无机磷酸，从而有利于动物对磷元素的吸收，并可减轻磷元素对环境的污染。本论文首次鉴定了粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）植酸酶基因及其重组植酸酶的生化特性。通过序列比对，发现在N. cras
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植酸酶（myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase; EC3.1.3.8）能水解催化分解植酸生成无机磷酸和肌醇。植酸酶可分解植物来源饲料中的植酸生成无机磷酸，从而有利于动物对磷元素的吸收，并可减轻磷元素对环境的污染。本论文首次鉴定了粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）植酸酶基因及其重组植酸酶的生化特性。通过序列比对，发现在N. crassa基因组中有一长为1507bp的编码基因与黑曲霉、无花果烟曲霉、土曲霉等微生物植酸酶基因的植酸酶编码基因有一定的同源性，且该基因的结构基因中含有微生物植酸酶常有的活性中心保守序列RHG×R×P。通过PCR扩增出其结构基因，PCR产物经EcoR I酶切后插入表达载体pYX212，得到正向连接产物pYX212-phy，转化酿酒酵母S. cerevisiae W303-1A，得到胞内表达植酸酶的酿酒酵母重组菌，鉴定该基因为植酸酶基因。将N. crassa植酸酶基因插入到带有酵母信号肽α因子的表达载体pPIC9K的EcoR I位点，正向连接的重组质粒pPIC9K-phy 经Nco I酶切纯化后，电转化入巴斯德毕赤氏酵母KM71。重组菌经甲醇诱导表达出有活性的植酸酶。经透析、超滤浓缩以及Superdex 200、DEAE-52阴离子交换柱分离纯化后得到纯酶，SDS-PAGE结果显示该重组蛋白分子量为60 kD。重组酶的比酶活为125 U/mg。对该重组酶的生化性质研究发现该酶在pH 2.5~7.5之间有植酸酶活性，有两个最适pH，分别为3.5、5.5，且能在较宽的pH范围内保持较高的酶活；最适反应温度为60℃；Km和Vmax值分别为228 ?M、128 ?mol/mg pro.min-1。在测试条件下，该酶在pH3.5~9.5之间，有较好的pH稳定性；该酶在70~90℃放置20 min，重组酶保留39~58 %的酶活。研究还发现，Cu2+对该酶有强抑制作用，Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Co2+、Zn2+和EDTA等对其酶活影响不大。
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