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目的:
以豁眼鹅为试验材料,构建豁眼鹅细菌人工染色体文库,并对文库进行质量鉴定,为永久保存和利用其遗传资源、开展与其重要经济性状相关的功能基因筛选研究提供试验材料和技术保证。
方法:
采集豁眼鹅翅静脉血,利用琼脂糖包埋法获得高分子质量(HMW)DNA;通过Hind Ⅲ、EcoRI和BamH I 3 种限制性内切酶酶切浓度梯度预实验,得到最佳酶切反应条件,并进行二次脉冲电泳分离并回收100 kb~500 kb的DNA 片段;利用电洗脱方法将DNA 片段从琼脂糖凝胶块上洗脱下来,并使用PEG8000 对其进行浓缩和纯化处理;以pBeloBAC11 为载体,进行连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞;利用蓝白斑筛选挑取和保存阳性单克隆;对保存的文库进行插入片段大小、克隆稳定性和基因组覆盖率等方面的质量鉴定。
结果:
酶切浓度梯度试验表明,Hind Ⅲ为最佳限制性内切酶,且最佳酶用量为40 U/μL Hind Ⅲ。
本研究共挑取了115,200个克隆,随机挑选了100个BAC 克隆,对其外源插入片段大小的分析表明,外源插入片段在40 kb~200 kb之间,平均大小为102 kb,空克隆的比例为0.6%,基因组覆盖率为11.4 倍。将BAC 克隆保存于300 块384 孔板中。挑选5个较大片段的BAC 克隆,连续转接培养5天,每天代表20 代,分别提取第一天和第五天的质粒DNA,进行Hind Ⅲ酶切及琼脂糖凝胶电泳分析以确定文库的稳定性,结果表明带型无明显差异,说明BAC 克隆在连续转接培养过程中十分稳定。
结论:
本研究成功构建了含115,200个克隆的豁眼鹅细菌人工染色体文库。该文库具有外源插入片段大、基因组覆盖率高、空载率低等特点。
对文库的质量检测证实所构建的文库可满足相关试验的需要;BAC 克隆经继代培养说明所得到的豁眼鹅BAC系统十分稳定。本研究构建的豁眼鹅细菌人工染色体文库适用于功能基因克隆和物理图谱构建等研究。