论文部分内容阅读
牡丹(Paeonia sect. Moutan)是中国传统名花,具有重要的观赏、药用和油用价值。常规杂交育种手段虽培育了许多优良牡丹新品种,但存在育种周期长,效率低等问题,且牡丹基因组杂合度高,大部分重要性状是数量性状使得牡丹育种工作进展缓慢。分子标记辅助选择育种(Marker-assisted selection, MAS)是利用分子标记与控制目标性状基因紧密连锁的特点,能够快速准确筛选优势基因型,提高育种效率,是现代牡丹育种的发展方向之一。为此,本研究以我国牡丹家族中重要成员紫斑牡丹(Paeonia rockii)栽培群体为材料,在利用牡丹转录组序列开发微卫星标记的基础上,通过利用关联群体分析和杂交群体验证,首次开展了紫斑牡丹关联作图研究,获得了与牡丹重要性状显著关联的分子标记,并挖掘其优异等位变异位点。主要研究结果如下：(1)SSR分子标记开发是本研究工作开展的基础。通过对牡丹转录组59275条Unigenes序列分析,从3787条Unigenes序列中鉴定出4373个EST-SSRs,平均每9.24kb含有一个SSR位点,其中二核苷酸重复(46.26%)是最丰富的类型,其次是三、六、四和五核苷酸重复；利用Primer premier 5.0设计引物,选择合成了788对SSR引物,其中373对引物(47.3%)成功扩增,149对引物(39.9%)在杂交群体的双亲中具有多态性。随机选取30对引物检测36个牡丹样本的多态性和芍药属9个种间个体的通用性,多态性信息含量范围从0.36到0.85,平均为0.69；通用性检测发现,95.3%的EST-SSR标记可在9个种中有效扩增。此外,利用30对标记分析了56个芍药属样本的亲缘关系,Neighbor-Joining (NJ)聚类分析表明主要集群与已知的谱系树一致。研究结果表明新开发的EST-SSR标记为开展牡丹分子标记辅助育种提供了重要的遗传资源。(2)关联群体的选择及评价是关联分析的第一步,至关重要。本研究筛选了一个由462株紫斑牡丹个体组成的栽培群体,对其29个数量性状进行了统计分析显示,不同基因型间表型变异差异极显著(P<0.01),遗传变异系数为9.52%-112.10%,且在群体中呈现出正态分布的规律,其中果实性状平均遗传变异最大(41.69%),其次为叶部性状(24.17%),在不考虑花瓣数性状的情况下,花部性状平均遗传变异最小(17.25%),相对比较稳定；主成分分析表明表型变异在该群体内均匀分布,无显著的层次结构。6个质量性状表型频率分布,表明群体中质量性状变异类型丰富。上述结果表明,本研究群体表型变异丰富,具有代表性,是关联分析研究的合适群体。(3)群体遗传多样性及群体结构评价是开展关联作图的前提。利用40对EST-SSR标记对紫斑牡丹关联群体的462株个体进行了遗传多样性评价,共确定了183个等位位点,等位基因数范围为2-10,平均等位基因数为4.5,显示了该群体具有中等遗传多样性水平。采用三种方法分析群体结构,结果表明,三种方法均将紫斑牡丹关联群体划分为3个亚群体(K=3)。(4)连锁不平衡检测发现紫斑牡丹关联群体所用SSR标记间连锁不平衡水平较低,大部分标记位点处于显著的连锁平衡状态(r2<0.1；P<0.001)。利用混合线性模型进行单标记关联分析发现：确定了37个SSR标记与11个花部性状组成的46个显著关联,单标记可解释表型变异的2.68%-23.97%,平均解释率为5.50%；确定了21个SSR标记与6个叶部性状组成的25个显著关联,单标记解释变异率范围为2.19%-7.15%,平均解释率为5.38%；确定了28个SSR标记与7个果实性状组成的64个显著关联,单标记解释变异率范围为2.21%-29.62%,平均解释率为7.56%。(5)在关联群体和杂交群体两个作图群体中同时出现的显著关联组合共计13个,其中与花部、叶部和果实性状有关的显著关联分别有5、1和7个。在这两个群体内,具有一致效应的显著关联组合共计9个(4个正效应和5个负效应),获得了与外瓣宽、外瓣形状、花色、单果种子干重、单果种子数和单果种子鲜重显著关联的标记,并进一步统计了显著关联标记的优势等位位点信息。综上所述,本研究利用转录组序列开发的EST-SSR分子标记,首次开展了紫斑牡丹栽培群体的关联分析研究,获得了与重要性状显著关联的标记,为牡丹相关性状的基因定位及分子标记辅助育种工作奠定了重要的基础。