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卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占85%-90%。尽管化疗方案不断优化,但是EOC治疗效果却不尽人意,5年生存率仍徘徊于30%-40%,复发率超过60%,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。EOC已成为严重威胁女性生命和健康的恶性肿瘤。癌干细胞（cancer stem cell,CSC）是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、分化、无限增殖等干细胞特性的肿瘤细胞,是肿瘤发生发展的根源,与肿瘤的化疗耐药、转移侵袭以及复发密切相关。所以,探究EOC CSC的特性,寻找针对靶向CSC治疗EOC有效方法,是控制并根治卵巢癌的关键。近年来肿瘤免疫治疗受到高度关注,在基础研究和临床应用研究方面都取得了一些可喜的进展,而针对靶向CSC的免疫治疗目前主要倾向于:靶向CSC表型的免疫治疗、靶向CSC的T细胞过继免疫、靶向CSC的DC疫苗、靶向CSC憩室的免疫治疗、免疫检查点、CSC疫苗等,特别是疫苗研究,因其能激活机体的自然杀伤细胞（NK）和特异性细胞毒性T细胞（CTL）、产生抗肿瘤的保护性抗体等免疫应答,是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗方法。然而,由于肿瘤抗原免疫原性较弱、肿瘤的异质性、肿瘤免疫逃逸机制的复杂性等原因,尽管有众多的可喜研究报道,但肿瘤疫苗的实际疗效与预期效果仍有很大的差距,要作为治疗性肿瘤疫苗用于临床,仍有一些障碍需要克服,关键是如何提高肿瘤疫苗免疫原性,激发宿主免疫反应对瘤细胞免疫攻击。最新研究显示,CSC疫苗因其高表达优势抗原,可引发有效的靶向CSC免疫反应,达到抑制肿瘤生长和转移的效应,更引人关注。本课题组前期研究已发现,CD44+CD117+的EOC SKOV3/HO8910细胞具有CSC特性。因此,本研究将EOC CSC分离出来,采用简捷的工艺方法直接制备溶解完整的CSC疫苗,探究该疫苗抗卵巢癌效应及其机制。目的:探究EOC CSC疫苗在动物体内诱发抗肿瘤效应及其可能机制,为今后临床上使用该疫苗防治卵巢癌提供实验和理论依据。方法:1.通过免疫磁珠分选系统（MACS）从人EOC SKOV3/HO8910两种细胞系中分离出CD117+CD44+CSC,经反复冻融三次将其制备成CSC疫苗再接种到免疫缺陷的裸鼠体内（4×105CD117+CD44+CSC/鼠）,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用5×106个野生型SKOV3/HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。通过观察体内肿瘤生长及各免疫小鼠生存情况,初步评价SKOV3和HO8910 CSC疫苗的抗癌效果。通过流式细胞仪（FCM）分析免疫鼠肿瘤细胞的CD117+CD44+亚群以及I型乙醛脱氢酶高表达(ALDH-1high)细胞群比例;此外,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠外周血清IFN-γ和TGF-β细胞因子水平,细胞杀伤实验测定NK细胞杀伤能力,实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western blotting）检测小鼠肿瘤组织中颗粒酶和穿孔素以及NKG2D和MICA的表达水平,初步分析抗瘤效应及其分子机制。同时,经NOD/SCID鼠模型反向验证CSC疫苗的免疫效应。2.因受体酪氨酸激酶孤儿样受体1（ROR1）分子可能是EOC CSC的一种优势抗原,在CSC疫苗激发机体免疫反应中具有重要作用。本研究分别设计针对ROR1基因序列短发夹RNA（shROR1）以及采用Gateway位点专一性重组方法,扩增ROR1序列,分别构建下调或上调ROR1的慢病毒重组质粒（pLV-shROR1或pLV-ovROR1）,进行慢病毒包装,利用倍比稀释法测定病毒滴度,再将含有pLV-shROR1和pLV-ovROR1慢病毒感染细胞,筛选出稳定表达ROR1的细胞克隆并扩大培养。用MACS分离出HO8910-pLV-shROR1 CD117+CD44+CSC（简称HO8910-shROR1 CSC）和HO8910-pLV-ovROR1CD117+CD44+CSC（HO8910-ovROR1 CSC）,用上述同样方法制备成疫苗后接种到免疫缺陷的裸鼠体内,再用5×106个野生型HO8910细胞皮下攻击免疫小鼠。经体内致瘤实验分别评价下调或上调ROR1的HO8910 CSC疫苗的抗癌效果;FCM、ELISA、NK杀伤实验、qRT-PCR、Western blotting等实验进一步分析优势抗原ROR1对HO8910 CSC疫苗抗瘤效应的影响。3.用无血清培养法（SFM）,筛选出鼠源性EOC细胞株ID8卵巢癌干样细胞（OCSC）,取2×105OCSC经反复冻融三次将其制备成疫苗,接种到C57BL/6小鼠体内,总共三次,每两次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,再用2×106个野生型ID8细胞皮下攻击免疫小鼠,观察免疫小鼠生存和肿瘤生长情况。继而构建下调ROR1的重组质粒,进行慢病毒包装并使用倍比稀释法测定病毒滴度,将含有pLV-shROR1的慢病毒感染小鼠卵巢癌ID8细胞,用qRT-PCR和Western bloting分析ID8细胞中ROR1分子下调表达情况。再用上述同样方法,在C57BL/6小鼠体内评价ID8-OCSC和ID8-OCSC-shROR1疫苗抗癌效果。采用FCM、ELISA、NK杀伤实验、CD4+T和CD8+T细胞杀伤实验、补体依赖的细胞毒活性（CDC）,qRT-PCR和Western blotting进一步分析疫苗诱发的免疫反应以及抗瘤效应与机制。此外,本研究还进行了用树突状细胞（DC）负载OCSC裂解物用于疫苗实验,试图比较两种方法制备的疫苗在诱导免疫鼠抗EOC效应是否有明显差异。结果:1.疫苗免疫鼠肿瘤体积大小、瘤体生长曲线及小鼠无瘤生存期显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能在无胸腺裸鼠体内中诱导免疫反应,体现在接种CD117+CD44+CSC疫苗的小鼠,与non-CD117+CD44+CSC疫苗组和SKOV3/HO8910细胞疫苗组及PBS组相比,肿瘤形成时间延迟、肿瘤体积较小、荷瘤鼠生存时间延长;血清中IFN-γ水平升高,TGF-β水平降低,且具有较强的NK杀伤活性。这些结果与不同对照组相比,差异有显著性意义（p（27）0.05）。另外,qRT-PCR结果显示,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗免疫的小鼠肿瘤组织中,具有更高水平的穿孔素和颗粒酶表达;同时,qRT-PCR和Western blotting结果显示,肿瘤组织中具有高水平的NKG2D和MIC A表达（p（27）0.05）。此外,SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能够显著地减少小鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC细胞群以及ALDH-1high细胞群比例。结果提示:SKOV3/HO8910CSC疫苗能靶向杀伤EOC CSC,抑制裸鼠体内肿瘤生长;而在NOD/SCID鼠模型因其T和B淋巴细胞严重缺乏,却没有明显抑瘤效应,从而反向证明了CSC疫苗的抗瘤效应是因其诱发免疫效应所致。2.分别筛选出感染pLV-shROR1的HO8910-pLV-shROR1细胞（简称HO8910-shROR1）和过表达ROR1分子的HO8910-pLV-ROR1细胞（简称HO8910-ovROR1）。qRT-PCR和Western blotting分析显示,ROR1分子分别被有效地下调和上调,表明从基因和蛋白水平证实,在HO8910细胞调控ROR1表达成功。HO8910-shROR1或HO8910-ovROR1细胞扩大培养后,经MACS分选出CD117+CD44+CSC,制备疫苗免疫裸鼠结果显示,HO8910-shROR1和HO8910-ovROR1以及HO8910三组CD117+CD44+CSC疫苗,在免疫鼠激发的抗HO8910卵巢癌效应中,HO8910-ovROR1 CSC疫苗抗瘤效果最强,小鼠肿瘤生长最慢,体积最小,无瘤生存期最长,HO8910 CSC疫苗次之（p（27）0.05）,HO8910-shROR1疫苗最低（p（27）0.05）。ROR1高表达的HO8910-ovROR1 CSC疫苗免疫鼠,在三组疫苗免疫鼠中,血清IFN-γ和抗ROR1水平最高,而TGF-β水平最低;同时,NK杀伤能力也最强。qRT-PCR结果显示HO8910-ovROR1 CSC疫苗组,小鼠肿瘤组织中含有较高水平的颗粒酶和穿孔素,qRT-PCR和Western blotting显示,表达高水平NKG2D和MIC A（p（27）0.05）。此外,以HO8910-ovROR1 CSC为基础的疫苗能够更明显地下调裸鼠卵巢癌异体移植瘤组织中CD117+CD44+CSC亚群以及ALDHhigh细胞群的比例。以上结果证实:ROR1分子可能是EOC CSC疫苗的优势抗原,在HO8910 CSC疫苗中发挥关键的免疫原性作用。3.ID8-OCSC疫苗在C57BL/6小鼠体内抗肿瘤实验结果显示,从肿瘤生长速度、肿瘤大小以及无瘤生存期显示方面,明显优于非ID8-OCSC疫苗组,差异有统计学意义（p<0.05）。将ROR1分子下调后,ID8-OCSC-shROR1疫苗组小鼠的抗肿瘤效应显著弱于ID8-OCSC疫苗组（p<0.05）,且NK细胞和脾细胞杀伤能力、抗体水平、CDC活性、血清IFN-γ水平等均显著下降（p<0.05）,但TGF-β水平则升高（p（27）0.05）。对ID8-OCSC疫苗激发免疫鼠脾脏T细胞功能检测显示,分离的CD4+T和CD8+T细胞对靶细胞杀伤实验与与ID8-OCSC-shROR1疫苗相相比,ID8-OCSC疫苗免疫鼠的CD4+T和CD8+T杀伤能力最强,特别是CD8+T的杀伤能力更为明显。qRT-PCR分析显示,ID8-OCSC疫苗组瘤组织中颗粒酶和穿孔素分子表达高于ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组;同时,NKG2D和MIC A的水平也高于其他对照组,差异有显著性意义（p（27）0.05）。此外,FCM分析肿瘤组织中ALDHhigh细胞群比例明显减少,而ID8-OCSC-shROR1和ID8疫苗组依次增高,提示ID8-OCSC疫苗能诱导免疫鼠靶向杀伤OCSC。该结果不仅说明ID8 OCSC疫苗有较强的抗肿瘤免疫效应,而且进一步证实ROR1分子可能是ID8 OCSC疫苗的优势抗原,当其下调后,在C57BL/6小鼠诱发抗肿瘤免疫效应也随之减弱。此外,反复冻融OCSC制备的疫苗与反复冻融OCSC负载DC制备的疫苗诱导小鼠的抗EOC效应相似,虽略有差异,但无统计学意义。结论:1.人源性EOC SKOV3/HO8910 CD117+CD44+CSC疫苗能诱导免疫鼠产生抗肿瘤效应,拮抗卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原诱导强免疫反应相关,下调或上调ROR1分子表达,可影响CSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。2.鼠源性ID8 OCSC疫苗能诱发C57BL/6免疫鼠产生免疫效应而抑制卵巢癌生长,其效应机制与其高表达ROR1优势抗原相关,下调ROR1分子表达,可影响ID8 OCSC疫苗的免疫效应和抗卵巢癌效应。3.本研究制备的EOC CSC疫苗有效地增强免疫鼠产生抗肿瘤效应,这为临床上应用CSC疫苗免疫防治EOC提供了科学的实验依据。